對胚胎工程中幾個疑難問題的解釋

張計輝

[摘 要]在學習《現代生物科技專題》胚胎工程內容的過程中，學生常會遇到較多的疑難問題。基于此，針對胚胎工程中的精子獲能培養液成分、胚胎的冷凍保存、母牛是否妊娠的檢查及飼養層細胞的有關疑難問題做進一步的解釋，以幫助學生有效突破學習難點。

[關鍵詞]胚胎工程；疑難問題；精子獲能；冷凍保存；妊娠檢查；飼養層細胞

[中圖分類號] G633.91 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-6058（2018）20-0096-01

在《現代生物科技專題》之“胚胎工程”的學習中，有些內容較難理解，但教材只給出了實際的應用情況，對其原理并沒有做進一步闡述，使學生產生疑問。本文就胚胎工程中的幾個疑難問題進行了解釋。

疑問1：精子為什么要獲能？人工配制的獲能液的主要成分是什么？化學培養法中為何要加入肝素或Ca2+離子載體？

精子獲能的原理：成熟的精子本身具有受精能力，但由附睪分泌的物質附于精子表面（稱為質膜），阻止了頂體酶的釋放。精子獲能是指精子質膜表面的糖蛋白被降解，同時質膜中膽固醇的量發生變化，質膜穩定性降低，頂體酶得以釋放的過程。因此精子需要獲能。

人工配制的獲能液的成分：TYH精子獲能液是為精子所配備的碳酸氫鹽緩沖液，可在預備受精時滿足精子獲能的各種需要。組分主要有NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaHCO[-3]、CaCl2、丙酮酸鈉、甲基-β-環糊精等。高濃度的HCO[-3]能夠使質膜表面均勻分布的膽固醇集中到精子頭部頂端，甲基-β-環糊精能夠移去質膜上的膽固醇，從而破壞質膜的完整性，丙酮酸鈉則作為能量的來源。

化學培養法中添加物質的作用：肝素是硫酸化程度最高的氨基多糖。氨基多糖可通過結合和去除精子質膜上抑制獲能的蛋白來刺激獲能。“A23187”載體是一種移動性離子載體，加入到含有Ca2+的細胞培養液中，則Ca2+很快進入到細胞質內，Ca2+濃度升高可誘導頂體酶的活性。

疑問2：細胞在-196℃液氮中保存，細胞不會被凍死嗎？

細胞被冷凍的過程可分為液晶態和玻璃態兩種狀態，由前者進入后者。目前，細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。

細胞在不加保護劑的情況下直接冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應，如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變；部分蛋白質變性，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內結構成分遭到破壞；線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙，細胞核DNA空間構型發生不可逆的損傷，而致細胞死亡；等等。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。

采用甘油或二甲基亞砜做保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。緩慢冷凍法又可使細胞內的水分滲出細胞外，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。因此，胚胎在 -196℃液氮中保存可以不被凍死。

疑問3：如何進行受體母牛的妊娠檢查？

對母牛進行妊娠檢查常用的方法有直腸檢測法、陰道檢查法、激素診斷法、看“眼線”法等，均在配種后25～30天后進行檢查。課本圖示的方法為直腸檢測法。

直腸檢測法：通過直腸內壁觸摸卵巢上的黃體變化及子宮的變化來判斷奶牛是否妊娠。母牛配種后30天檢查，此時排卵側卵巢體積增大到原來的1倍，同核桃大甚至雞蛋大，質地較硬，黃體明顯凸出于卵巢表面，而另一側卵巢無變化；子宮角大于空角，增粗、質地松軟，有波動感，觸摸時無收縮反應，可判定為妊娠。陰道檢查法：陰道黏膜蒼白，無光澤；子宮頸口偏向一側，呈閉鎖狀態，被灰暗濃稠的黏液所封閉。激素診斷法：用乙烯雌酚10 mg，一次肌肉注射。已妊娠者無發情表現；未妊娠者第2天便表現出明顯發情。看“眼線”法：在瞳孔的正下方鞏膜表面，有明顯的縱向血管1～2條（個別也有3條的），呈直線狀態，顏色深紅，輪廓清晰，又沒有任何發情表現，則為妊娠。

疑問4：什么是飼養層細胞？為什么它能夠使細胞分裂而不分化？

飼養層細胞是經過射線照射或絲裂霉素C（有絲分裂阻斷劑）處理后，用作克隆細胞附著底物且能產生多種營養因子的細胞。常見的飼養層細胞有顆粒細胞、成纖維細胞、輸卵管上皮細胞等，飼養層細胞經有絲分裂阻斷劑處理后雖然失去了分裂能力，但仍然保持生存能力。

在細胞體外培養中，先培養一層飼養層細胞，然后在其上接種要實驗的細胞，這樣更能模擬體內環境。飼養層細胞可為所培養的細胞提供它們在體外存活增殖所必需的生長因子，還會產生能抑制細胞自發性分化的多肽細胞因子，所以飼養層細胞可以使培養的細胞保持分裂而不分化的狀態。

（責任編輯 黃春香）