白英提取物抑瘤有效成分的初步篩選

王衛芳，劉 悅，吳廣謀，楊 唐，張 迪，徐雅娟*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.吉林省中醫藥科學院，長春 130012；

3.軍事醫學研究院軍事獸醫研究所，長春 130122）

白英（Solanum lyratum Thunb.），是一種常用抗癌中草藥[1]，為茄科多年生草質藤本植物，別名白毛藤、蜀羊泉等[2]。近年來，國內外學者對白英的藥理活性做了大量的研究，其熱點主要集中于抗肺癌[3]、肝癌[4-5]、抗炎[6]、抗過敏[7-8]、保肝[9]、增強免疫作用[10]等方面。并對成分進行了分析[11-16]，目前對不同的白英提取物的作用機制有了初步的了解[17-20]，但仍需進一步明確。本研究初步篩選白英水提液的不同部位對人宮頸癌細胞HeLa、人胃癌細胞BGC -823細胞是否具有抑制增殖活性及誘導凋亡作用，從而確定白英水提液抗腫瘤作用有效部位，為進一步探討其分子水平機制及抗癌新藥的開發，奠定一定的理論及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基（HyClone公司）、胎牛血清（Gibco公司）、Cell Counting Kit-8 試劑盒（MCE公司）。

1.2 細胞株培養 細胞培養于含10%胎牛血清、1%抗菌藥物（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）的DMEM高糖培養基中，放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度條件的細胞培養箱中常規培養。細胞呈單層貼壁生長，依細胞生長情況換液，待細胞長至鋪滿瓶底，以0.25%胰酶消化傳代。

1.3 實驗分組 空白對照組（加入等量的完全培養基）；實驗組按白英提取物的濃度分為5個劑量組；陰性對照組為含細胞的DMEM培養液；陽性對照組為DMEM培養液倍比稀釋的5-Fu注射液。

1.4 CCK-8法測定細胞增殖抑制率 每種藥物濃度設6個平行孔，培養48 h，加入10 μL CCK-8培養1h后，酶標儀測定450 nm各孔的OD值，以培養液調零。按公式計算細胞生長抑制率（IR，inhibition rate）。

抑制率IR = [（Ac-As）/（Ac-Ab）] × 100% 。其中，As：實驗孔吸光度 （含細胞、培養基、CCK-8 溶液和藥物溶液）； Ac：對照孔吸光度（含細胞、培養基、CCK-8 溶液，不含藥物）； Ab：空白孔吸光度（含培養基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物）。

1.5 形態學觀察 將人宮頸癌HeLa細胞鋪于六孔板內，細胞貼壁后，加入不同濃度的白英藥物作用24 h，吸棄培養基，PBS沖洗2次，每孔加入1 mL培養基，于倒置顯微鏡下觀察細胞數量和形態并拍照。

1.6 HE（蘇木精/伊紅）染色 胰酶消化貼壁生長的HeLa細胞，調整細胞濃度為1 ×105個/mL，滴加到置于24孔板底部的蓋玻片上，制作細胞爬片，24 h后加入不同濃度白英藥物，繼續培養24 h取出爬片，PBS清洗2次，95%乙醇固定15 min，PBS清洗3次，每次1 min。蘇木素染色10 min，蒸餾水沖洗1 min。1%鹽酸酒精分化1 min，蒸餾水沖洗1 min，1%稀氨水返藍5 min，蒸餾水沖洗1 min，浸入0.5%伊紅中5 min，蒸餾水沖洗1 min，分別浸入80%、90%、95%乙醇1 min，共2次，無水乙醇1 min共2次，自來水清洗l min。伊紅染色1 min，自來水清洗30 s。普通光學顯微鏡下觀察。

1.7 AO/EB（吖啶橙/溴化乙啶）染色 取對數生長期的細胞，以0.25%胰酶消化，收集細胞，計數，接種在24孔板中。細胞貼壁后，將細胞培養液換為含不同濃度白英藥物的新鮮培養基，繼續常規培養。培養24 h后，棄去培養基，PBS清洗去除殘余培養基和未貼壁細胞，加入新的PBS。按照每毫升PBS中加入20 μL工作液（100 μg/mL AO溶液和100 μg/mL EB溶液按1：1混合）。室溫放置2～5 min后于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（x± s ）表示，組間比較采用單因素ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 白英提取物體外對HeLa細胞、BGC-823細胞的增殖抑制作用 實驗結果顯示，白英提取物5個濃度對人宮頸癌HeLa細胞和胃癌BGC-823細胞作用72 h后，有明顯的抑制作用。統計學分析表明，不同濃度的藥物對細胞抑制率存在差異，但藥物濃度超過0.135 3 mg/mL時，大部分細胞都產生形變，貼壁能力下降，呈漂浮現象，抑制率反而下降。濃度為0.067 6 mg/mL時，對2種細胞的抑制率達到最大，分別為86.21%和88.91%。白英提取物干預后，對相同的細胞，與0.541 mg/mL濃度組比較，5個濃度組之間比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與5-Fu組相比，差異無統計學意 義（P＞0.05）；與BGC-823細胞組的抑制作用相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 白英提取物體外對HeLa細胞、BGC-823細胞的增殖抑制作用（x± s ）

2.2 HE染色 HE染色觀察不同濃度白英提取物作用Hela細胞48 h后細胞凋亡情況。隨著藥物濃度增加，實驗組可見凋亡細胞逐漸增多，高濃度組細胞呈碎塊狀致密濃染，中低濃度組可見部分細胞變圓，邊界較清晰，細胞漿被伊紅染成深淺不同的淡紅色。

2.3 AO/EB染色檢測白英提取物對細胞的作用 AO是DNA染料，能進入細胞膜正常的細胞中，與DNA結合發出綠色熒光；EB膜不通透性染料，可使壞死的細胞或者凋亡后期繼發性壞死細胞呈橙紅色。

未經藥物作用的陰性對照細胞被AO染成綠色，高濃度（5 mg/mL）藥物作用后細胞形態發生明顯的變化，形態由正常的梭形變成了橢圓形或圓形，細胞核被染成桔紅色，膜出現泡狀突起，凋亡細胞比例逐漸增多，細胞核碎裂，呈現出凋亡性死亡，同時出現一些被染成致密橙紅色的壞死細胞；中濃度藥物（2.5 mg/mL）作用后，一些細胞的胞質被染成黃綠色，一些細胞的細胞核碎裂，胞漿濃縮，聚集于一邊，呈塊狀或新月狀；低濃度藥物作用時，少量細胞出現凋亡現象。

3 討論

腫瘤是目前嚴重威脅人類健康的主要疾病之一。尋找有效的抗癌藥物與方法，使人們的生活遠離癌癥，是引起世界醫學界重視的一個重要的研究課題。傳統的治療方法在殺傷腫瘤細胞的同時也會對正常細胞有一定的影響，治療中出現明顯的不良反應，因此天然藥物、靶向藥物、傳統中藥的作用效果和作用機制越來越受到人們的關注和應用。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡（PCD），多種因素可以誘導細胞凋亡，可以影響癌細胞的生長和繁殖。目前發現多種傳統中藥能有效的對抗癌癥的進展，但是中藥治療腫瘤、引起細胞凋亡的機制還不是非常明確。細胞凋亡途徑一般可以分為死亡受體通路、線粒體途徑和內質網應激途徑。影響細胞凋亡的基因有細胞凋亡過程中的表達基因、促凋亡基因和抑胞凋亡基因。其異常與多種疾病密切相關，如腫瘤、免疫疾病等。Bcl-2家族是迄今為止被研究較多的細胞凋亡基因之一。其中包括Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白及Bax和Bak等促細胞凋亡蛋白。一些傳統中藥被報道通過影響Bax/Bcl-2比例的變化來調控細胞凋亡。以及caspase、Fas等蛋白、線粒體膜電位變化、NF-κB 途徑等都會影響細胞凋亡[21-22]。因此，細胞凋亡的發生及調控機制非常復雜，需要我們進一步去深入研究。

綜上所述，白英提取物能誘導HeLa、BGC-823細胞的凋亡，有效部位的抑瘤率不同。然而，白英提取物的有效部位活性成分及其抗癌機制還有待進一步的實驗研究。