不同時(shí)間煎煮防風(fēng)對(duì)防風(fēng)散中有效成分含量及藥效學(xué)的影響

黃曉巍，李 鑫，吳月征，趙昕彤，葉豆丹，辛 國

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林省中藥生物大分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021）

防風(fēng)散始載于《普濟(jì)方》[1]：“防風(fēng)、連翹、山梔子、甘草各等分，治小兒傷寒及諸熱。兼治瘡痘入目生翳。”防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk的干燥根，性微溫、味辛甘，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛等功效[2]。早于明代陶華所著《傷寒六書》中就有對(duì)防風(fēng)入湯劑宜先煎的相關(guān)記載：“一用風(fēng)病藥，先煎防風(fēng)一二沸，后入余藥同煎”[3]，故認(rèn)為防風(fēng)入湯劑宜先煎，但在《中華人民共和國藥典》（2015版）[4]中并未對(duì)其做出明確闡述。本文現(xiàn)通過觀察防風(fēng)先煎時(shí)間對(duì)防風(fēng)散中的有效成分含量變化及藥效學(xué)的影響，明確防風(fēng)散中防風(fēng)先煎的最佳時(shí)間，為防風(fēng)的特殊煎煮方法在臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 ICR小鼠，SPF級(jí)，雌性180只，雄性60只，體質(zhì)量18～22 g，由長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（吉）2016-0003。

1.2 藥物及試劑 升麻素苷對(duì)照品，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B21157；，5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào) B21823；防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk，安國市輝發(fā)中藥飲片加工有限公司，批號(hào)160901； 連 翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl，河北祁一堂藥業(yè)有限公司，批號(hào) 1609017；梔子Gardenia jasminoides Ellis，河北祁一堂藥業(yè)有限公司，批號(hào) 1704027；炙甘草G.glabra Linn，安國市輝發(fā)中藥飲片加工有限公司，批號(hào)160809。感冒疏風(fēng)片，吉林龍?chǎng)嗡帢I(yè)有限公司，批號(hào)151008100；去痛片，長春大政藥業(yè)科技有限公司，批號(hào)161235；枸櫞酸噴托維林片，天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)1611014.08。

1.3 儀器 島津高效液相色譜儀，十萬分之一天平，萬分之一分析天平，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，超聲波清洗器，煎藥壺，恒溫水浴鍋，智能熱板儀，隔離濕氣超聲波霧化器。

2 化學(xué)試驗(yàn)

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取防風(fēng)有效成分標(biāo)準(zhǔn)品各5.00 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，稀釋成含升麻素苷0.06 mg/mL，5-O-甲基維斯阿米醇苷0.06 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱量防風(fēng)50 g，加水500 mL浸泡30 min，另取連翹、梔子、甘草各50 g加1 000 mL水浸泡30 min，分別將防風(fēng)先煎0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，9個(gè)煎煮時(shí)間的防風(fēng)散濃縮干燥（80 ℃）至干膏（出膏率約為16.5%）研磨成粉末（過3號(hào)篩），精密量取粉末0.25 g，置500 mL錐形瓶中，量取甲醇10 mL，放入瓶中，稱量總體質(zhì)量記錄，之后放在水浴上回流2 h，冷卻至室溫，稱量總體質(zhì)量與回流前對(duì)比，如果質(zhì)量有所減少，加入甲醇補(bǔ)足重量，濾紙過濾，取續(xù)濾液即得9種不同煎煮時(shí)間的防風(fēng)供試品溶液。陰性對(duì)照組溶液的制備[5]，取連翹、梔子、甘草各50 g加1 000 mL水浸泡30 min，煎煮20 min，按上述方法制備即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：INERTSIL ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水（40：60），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL。在選定的色譜條件下，防風(fēng)有效成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)與拖尾因子符合《中華人民共和國藥典》（2015版）[4]要求。結(jié)果見圖1（插頁二）、圖2（插頁三）、圖3（插頁三）。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性考察 精密量取防風(fēng)有效成分標(biāo)準(zhǔn)品各5.00 mg，分別放入2個(gè)5 mL容量瓶中，加入甲醇搖晃使其充分溶解，然后定容。以此液為母液，分別精密移取，制成濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 2種標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以濃度 X（mg/mL） 為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出2種有效成分的回歸方程分別為：

結(jié)果表明，防風(fēng)2種有效成分在濃度為0.1～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系[6]。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)行液相檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次。得到升麻素苷的RSD（n = 6）為0.71%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD（n = 6）為0.76%，結(jié)果表明，儀器精密度良好[7]。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在 0、4、8、12、24、48 h精密吸取室溫下放置的2.2項(xiàng)下防風(fēng)先煎10 min的樣品溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值為指標(biāo)測(cè)定其穩(wěn)定性，升麻素苷的RSD（n = 6）為 0.85%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD（n = 6）為 0.77%。表明防風(fēng)散中的有效成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好[8]。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按照2.2項(xiàng)下煎煮6份防風(fēng)先煎10 min的防風(fēng)散，并進(jìn)行樣品處理，每份精密吸取10 μL進(jìn)行檢測(cè)。以回歸方程計(jì)算升麻素苷含量平均值（n = 6）為5.686 mg/g，RSD（n = 6）為 1.08%。5-O-甲基維斯阿米醇苷含量平均值（n = 6）為 1.883 mg/g，RSD（n = 6）為 1.21%[9]。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知有效成分含量為5.638 、1.909 mg/g的防風(fēng)先煎10 min防風(fēng)散浸膏6份，每份約0.05 g，分別加入相當(dāng)于樣品中2種主要成分含有量100%的對(duì)照品粉末，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。得到升麻素苷的回收率為100.4%，RSD（n = 6）為 1.21%。5-O-甲基維斯阿米醇苷的回收率為100.6%，RSD（n = 6）為 1.33%[10]。

2.4.6 樣品含量測(cè)定 分別吸取2.2項(xiàng)下9個(gè)煎煮時(shí)間的防風(fēng)散，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定[11]。9個(gè)樣品中防風(fēng)2種有效成分的含量，見表1。

表1 不同煎煮時(shí)間防風(fēng)2種有效成分的含量 mg/g

3 藥效學(xué)試驗(yàn)與結(jié)果

現(xiàn)代研究[12-14]表明，防風(fēng)散具有明顯鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛作用。故選擇鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行不同時(shí)間煎煮防風(fēng)的防風(fēng)散的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3.1 藥物制備 防風(fēng)散的制備：稱取防風(fēng)50 g，加500 mL水浸泡30 min，另取約連翹50 g，梔子50 g，甘草50 g加1 000 mL水浸泡30 min，依2.2項(xiàng)下時(shí)間要求進(jìn)行煎煮，并濃縮至含防風(fēng)濃度為1 g/mL，放涼，備用。

陽性藥物的制備：去痛片的制備，取藥品粉末11.150 g，用水50 mL制成濃度為0.230 g/mL溶液備用。枸櫞酸噴托維林片的制備，取藥品粉末0.570 g，加水50 mL制成濃度為0.011 4 g/mL溶液備用。感冒疏風(fēng)片的制備，取藥品粉末40.00 g，加水50 mL，制成濃度為0.800 g/mL溶液備用。

3.2 動(dòng)物分組及給藥 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，120只雌鼠隨機(jī)分為12組，每組10只，即模型對(duì)照組，感冒疏風(fēng)片組，去痛片組，不同煎煮時(shí)間的防風(fēng)散9組（依2.2項(xiàng)下時(shí)間要求進(jìn)行煎煮）及陰性對(duì)照組。鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)120只鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為12組，每組10只，即模型對(duì)照組，感冒疏風(fēng)片組，枸櫞酸噴托維林片組及不同煎煮時(shí)間的防風(fēng)散9組（依2.2項(xiàng)下時(shí)間要求進(jìn)行煎煮）。按0.02 mL/g劑量對(duì)各組小鼠灌胃給藥，模型對(duì)照組給予等體積的純凈水，連續(xù)給藥7 d。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn) 各組小鼠（雌雄各半）末次給藥1 h后，將小鼠放入霧化器中，以25%氨水定量噴霧引咳，記錄各組小鼠的咳嗽潛伏期（首次咳嗽的時(shí)間）和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)[15-16]。

結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，感冒疏風(fēng)片組、枸櫞酸噴托維林片組、防風(fēng)先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01）；感冒疏風(fēng)片組、枸櫞酸噴托維林片組、防風(fēng)先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽次數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)果見表2。

3.5 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 各組小鼠（雌性）末次給藥1 h后，將小鼠置于（55±0.5）℃的智能熱板儀上，記錄其足底接觸熱板到出現(xiàn)舔后足或跳躍的時(shí)間[17-18]。

結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，去痛片組、防風(fēng)先煎10、15 min組小鼠的痛閾時(shí)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），感冒疏風(fēng)片組、防風(fēng)先煎5、20、25 min組的痛閾時(shí)間明顯延長（P＜0.05），見表3。

表2 不同時(shí)間煎煮防風(fēng)的防風(fēng)散對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳作用（x± s ，n = 10）

表3 不同時(shí)間煎煮防風(fēng)的防風(fēng)散對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用（x± s ，n = 10）

4 小結(jié)

HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，防風(fēng)散中的有效成分含量隨煎煮時(shí)間延長而逐漸增加，至防風(fēng)煎煮30 min（即先煎10 min）時(shí)候含量最高，之后隨煎煮時(shí)間延長有效成分含量降低。可能原因主要為：隨著煎煮時(shí)間改變，防風(fēng)各有效成分之間可能產(chǎn)生分解反應(yīng)、聚合反應(yīng)等，也可能發(fā)生了有效成分之間的轉(zhuǎn)化。藥效學(xué)結(jié)果表明，與模型對(duì)照組相比，防風(fēng)先煎10 min組小鼠的痛閾時(shí)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），防風(fēng)先煎5、20、25 min組的痛閾時(shí)間明顯延長（P＜0.05）；防風(fēng)先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），其中煎煮30 min組的鎮(zhèn)咳效果最為顯著；感冒疏風(fēng)片組、枸櫞酸噴托維林片組、防風(fēng)散防風(fēng)先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽次數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01）。研究結(jié)果表明，防風(fēng)散中防風(fēng)有效成分的含量與防風(fēng)的煎煮時(shí)間有關(guān)，且有效成分的含量變化直接影響了防風(fēng)散的鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛的作用。綜上所述，防風(fēng)入湯劑宜先煎，最佳煎煮時(shí)間為30 min（即先煎10 min）。