梅花鹿茸I型膠原對骨質(zhì)疏松大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響

石曉征，李 娜，李曉華，曲曉波

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

鹿茸是一種極其珍稀名貴的動物藥，具有“生精補(bǔ)髓，養(yǎng)血益陽，強(qiáng)筋健骨”之功效[1]。鹿茸中含有包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的豐富的生物活性物質(zhì)，其中以膠原蛋白含量最為豐富[2]。膠原蛋白是一種可以構(gòu)成骨組織的結(jié)構(gòu)蛋白，包括許多種類。 其中I型膠原廣泛分布于皮膚、肌腱、骨骼等組織，可維持骨密度，常用于骨代謝性疾病及骨質(zhì)疏松癥的治療[3]。鹿茸中含有豐富的I型膠原，是其強(qiáng)筋健骨的根本所在。骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性骨病，臨床上在老年人及絕經(jīng)婦女群體中較為多見[4]。由于外界環(huán)境或自身原因?qū)е碌墓琴|(zhì)量減少和成骨不足，會進(jìn)一步引起骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨脆性的增加，形成骨質(zhì)疏松。隨著我國老齡化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也隨之大幅提高，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[5-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的Wnt/β-Catenin 信號通路因參與成骨細(xì)胞的增殖、分化過程，并影響其活性和功能，逐漸成為科研人員對防治骨質(zhì)疏松癥藥物研究的熱門方向。本課題組在此前的研究[8-12]中發(fā)現(xiàn)，梅花鹿茸膠原酶解物對其骨質(zhì)疏松大鼠具有一定的防治作用，并成功從梅花鹿茸膠原酶解物中分離純化得到梅花鹿茸I型膠原（SDC-I）。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察SDC-I對骨質(zhì)疏松大鼠的保護(hù)作用，并探索其作用機(jī)制是否與Wnt/β-Catenin 信號通路的激活相關(guān)，為SDC-I對骨質(zhì)疏松的防治提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 動物 健康清潔級Sprague Dawley（SD）大鼠，雌性，50 只，體質(zhì)量（200 ± 10） g，購自長春市憶斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號 SCXK（吉）2011-0004。

1.2 藥品與試劑 SDC-I（相對分子質(zhì)量 3.1×104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)56.89%）制備，長春中醫(yī)藥大學(xué)分子藥理實(shí)驗(yàn)室。Trizol，購自美國Invitrogen公司；DNA分子標(biāo)記，cDNA第一鏈合成試劑盒，2×SYBR PCR擴(kuò)增試劑盒均購自北京百泰克公司；溴化乙錠（EB），10×loading buffer購自日本Takara公司；引物合成，安徽通用生物系統(tǒng)有限公司。

1.3 主要儀器 分析天平，型號BT125D ，購自德國Sartorius 公司；冷凍離心機(jī)，型號5430R，雙能X線骨密度儀，型號DPx-L，購自美國LUNAR公司；PCR儀，型號Mastercycler ，購自德國 Eppondorf 公司；核酸電泳儀，型號Min-Sub ，購自美國 Bio-Rad 公司；制冰機(jī)，型號FHB100，購自上海比朗公司；超微量紫外分光光度計(jì)，型號Colibei ，購自德國伯赫公司。

1.4 模型建立及分組給藥 將50只SD雌性大鼠，隨機(jī)分為5組：即空白組，模型組，SDC-I低、中、高劑量組。進(jìn)行7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)，除空白組外，其余各組均進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)，建立大鼠骨質(zhì)疏松模型?？瞻捉M和模型組灌胃給藥等量生理鹽水，SDC-I低、中、高劑量組分別給予0.05、 0.1、0.2 g/kg SDC-I灌胃治療，每周給藥 6 d（每周日停藥），連續(xù)給藥90 d。

1.5 取材方法 給藥90 d后，將大鼠禁食1 d。經(jīng)腹主動脈取血，將血清進(jìn)行分離后，放入 - 80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫笥液笾晒牵瑢⑵渑c肌肉等其他組織剝?nèi)ゲ⑺榛?，放入事先?zhǔn)備好的無菌 EP管中，于- 80 ℃保存，備用。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 骨密度（BMD）測定 給藥前應(yīng)用X 線骨密度儀檢測各組大鼠股骨的 BMD，停止給藥后再次檢測各組大鼠 BMD，觀察給藥前后大鼠 BMD變化情況[13]。

1.6.2 最大載荷測定 取各組大鼠左后肢股骨，剔除股骨上的肌肉及其他組織，稱重。將取好的各組大鼠股骨置于生物力學(xué)測定儀基座上固定。啟動儀器，當(dāng)測定儀前端自動擠壓股骨斷裂時，記錄數(shù)值[14]。

1.6.3 血清生化指標(biāo)測定 應(yīng)用 ELISA 方法測定各組大鼠血清骨鈣素（BGP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）水平，具體操作步驟均嚴(yán)格按照各個試劑盒的說明書完成，應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

1.6.4 RT-PCR測定 將保存的各組大鼠股骨從- 80 ℃冰箱中取出，立即浸入液氮中，在液氮保護(hù)下，迅速研磨至細(xì)粉。應(yīng)用Trizol法提取各組大鼠骨組織中的總RNA，并利用瓊脂糖電泳檢測。取適量RNA按照試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，其余樣品加入1 mL無水乙醇，- 80 ℃保存?zhèn)溆?。設(shè)置程序：1）45 ℃，50 min；2）70 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用超微量紫外分光光度計(jì)檢測反轉(zhuǎn)錄液中cDNA的濃度。設(shè)置RT-PCR反應(yīng)程序： 95 ℃，起始模板預(yù)變性。1）95 ℃，20 s；2）65 ℃，10 s； 3）72 ℃ ，30 s，循環(huán)40次，終止反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參基因，分析各組樣品β-Catenin、LRP5 mRNA的相對表達(dá)量，進(jìn)行差異比較。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物堿基序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 軟件處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行Student’s t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，以 P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SDC-I對大鼠體質(zhì)量、BMD及最大載荷量的影響 見表2。

2.2 SDC-I對大鼠血清生化指標(biāo)的影響 見表3。

2.3 各組大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相對表達(dá)量比較 見表4。

表2 SDC-I對大鼠體質(zhì)量、BMD及最大載荷量的影響（x± s ，n = 10）

表3 SDC-I對大鼠血清生化指標(biāo)的影響（x± s ，n = 10） ng/mL

表4 各組大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相對表達(dá)量比較（x± s ，n = 10）

3 討論

研究[15]表明，Wnt/β-Catenin信號通路的失控和失衡與骨質(zhì)疏松的發(fā)生關(guān)系密切。此信號通路可通過更新干細(xì)胞、誘導(dǎo)分化、使成骨細(xì)胞發(fā)生、抑制各類骨組織細(xì)胞凋亡等多種方式增加骨量及骨密度[16]。其中，β-Catenin是此信號途徑中的最為關(guān)鍵的調(diào)控因子，穩(wěn)定的β-Catenin聚集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，方可啟動編碼成骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到調(diào)控骨組織細(xì)胞分化、發(fā)生、促成骨形成的目的。β-Catenin需要通過Wnt與LRP5/6在胞外結(jié)合，激發(fā)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使GSK-3β磷酸化失活，來維持自身的穩(wěn)定[17-18]。LRP5作為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜受體，不但可以穩(wěn)定β-Catenin，還可以保護(hù)成骨細(xì)胞的增殖、功能和存活不受影響，也是骨量形成過程中不可缺失的一環(huán)[19]。因此，Wnt/β-Catenin途徑是調(diào)控成骨細(xì)胞和骨形成不可或缺的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 當(dāng)此通路信號傳導(dǎo)失控時，將導(dǎo)致包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種骨骼性疾病的發(fā)生[20-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠雙側(cè)卵巢切除后，隨著大鼠BMD的降低，β-Catenin 和LRP5 mRNA 的表達(dá)顯著下降；而高劑量的SDC-I能在提高大鼠BMD 、最大載荷量及血清中的BGP水平的同時，有效上調(diào)β-Catenin和LRP5 mRNA 的表達(dá)。因此，SDC-I防治骨質(zhì)疏松大鼠的機(jī)制可能是通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi) β-Catenin 的穩(wěn)定、集聚、轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核中，來激活 Wnt/β-Catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)成骨分化，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將從去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型中分離培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞，結(jié)合基因敲除、miRNA等技術(shù)，深入探索SDC-I到底如何通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路發(fā)揮對骨質(zhì)疏松防治作用，進(jìn)一步闡明 SDC-I對骨質(zhì)疏松防治作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。