超濾法測定天麻素與不同血漿的蛋白結(jié)合率

鮑慧瑋，徐 陽，王 萌，楊 波*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；2.長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，長春 130031）

天麻素（gastrodine）是天麻的主要化學(xué)成分，是 《中華人民共和國藥典：一部》（2015年版）中天麻含量測定的指標(biāo)成分之一[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究[4-7]表明，天麻素在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中療效顯著，包括對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用、對帕金森病和老年性癡呆的防治作用、抑制神經(jīng)性疼痛、對腦神經(jīng)元的保護(hù)作用等方面。此外，天麻素還具有鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[8-9]。藥物的血漿蛋白結(jié)合率是藥代動力學(xué)中的重要參數(shù)，與藥物在體內(nèi)的吸收、代謝、分布和排泄等密切相關(guān)，對其今后藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要的意義，其高低直接影響藥效的發(fā)揮和給藥方案的制定。故本實(shí)驗(yàn)采用超濾法結(jié)合HPLC的方法對天麻素與小鼠、大鼠、家兔的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行研究與測定。

1 材料

1.1 儀器 LC-2030型高效液相色譜儀（日本島津公司）；超濾管（相對分子質(zhì)量截留值10 kD，Millopore公司）；H1650R 型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；AB135-S型電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（江蘇金壇市江南儀器制造廠）。

1.2 試藥 天麻素（批號：110807-200205，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，美國FISHER公司）；超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純。

1.3 動物及血漿 Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，雄性；ICR小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量（20±2）g；家兔，雄性，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，合格證號：SCXK（吉）-2016-0003、SCXK（吉）-2016-0004，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司。將小鼠、大鼠、家兔分別采用摘眼球、腹主動脈、耳緣靜脈方式取血，置肝素潤洗的離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上清，置4 ℃冰箱中備用。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇：水（10：90），體積流量1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為220 nm，進(jìn)樣體積為 10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 PBS溶液的配制 取磷酸二氫鉀1.36 g，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得磷酸鹽緩沖溶液（pH 為7.4）。

2.2.2 對照品溶液的配制 取天麻素對照品約50 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制得濃度為5.014 mg/mL的天麻素對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，置10 mL量瓶中，加入PBS溶液稀釋至刻度，即得濃度為1.002 8 mg/mL的天麻素對照品溶液。

2.2.3 血漿樣品溶液的處理 取已配制好的對照品溶液，分別精密移取5、20、50 μL于EP管中，再取小鼠、大鼠、家兔血漿950 μL分別加入上述溶液中（PBS溶液補(bǔ)足體積至1 000 μL），混勻，制得濃度分別為5、20、50 μg/mL的低、中、高3種天麻素血漿樣品溶液，置37 ℃水浴溫育2 h。分別吸取天麻素血漿樣品溶液500 μL至超濾管中，6 000 r/min離心20 min，即得不同濃度的超濾液。

2.2.4 空白血漿超濾液的配制 精密吸取PBS溶液50 μL置EP管中，再取小鼠、大鼠、家兔血漿950 μL分別加入其中，置37 ℃水浴溫育2 h。按照2.2.3項(xiàng)下制得空白血漿超濾液。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性 取上述對照品溶液，小鼠、大鼠、家兔血漿樣品超濾液和空白血漿超濾液按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，色譜圖見圖1（插頁一）（小鼠、大鼠、家兔血漿色譜峰基本相同，以大鼠血漿為代表）。如圖1所示，天麻素對照品峰形較好，理論塔板數(shù)不低于5 000，與其他色譜峰分離度較好，且無干擾，專屬性較好。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察 精密稱取11.20 mg的天麻素對照品至10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，即濃度為1.120 mg/mL的天麻素對照品母液。分別吸取天麻素對照品母液 10、20、50、100、300、600 μL置10 mL量瓶中，PBS稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.12、2.24、5.6、11.2、33.6、67.2 μg/mL的系列對照品溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相色譜中，記錄峰面積。以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。求得回歸方程：Y = 20 358 X - 307.03，r = 0.999 9，天麻素在1.12～67.2 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2和2.2.3項(xiàng)下天麻素對照品溶液和大鼠中濃度血漿樣品超濾液，分別在0、2、4、6、8、12 h注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，天麻素對照品溶液和中濃度血漿樣品超濾液峰面積的RSD值分別為0.23%和0.54%。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取6份2.2.2項(xiàng)下對照品溶液20 μL，按照2.2.3項(xiàng)下制得大鼠血漿樣品超濾液，在2.1色譜條件下進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明，血漿樣品超濾液濃度的RSD值為0.77%，該方法重復(fù)性良好。

3.2.4 精密度試驗(yàn) 取2.2.2和2.2.3項(xiàng)下天麻素對照品溶液和大鼠中濃度血漿樣品超濾液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件1 d連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值；連續(xù)進(jìn)樣6 d，記錄色譜峰面積，計(jì)算日間精密度的RSD值。結(jié)果表明，天麻素對照品溶液和中濃度血漿樣品超濾液的日內(nèi)精密度RSD值分別為0.89%、1.01%；日間精密度RSD值分別為1.25%、0.93%，該方法精密度良好。

3.2.5 回收率試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下天麻素對照品溶液，分別精密移取5、20、50 μL于EP管中，加入PBS至體積為1 000 μL，混勻，可得濃度為5、20、50 μg/mL的天麻素- PBS溶液，置37 ℃水浴溫育2 h。再各吸取500 μL溶液轉(zhuǎn)移至超濾管中，6 000 r/min離心20 min，制得低、中、高3種濃度的超濾液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，與相應(yīng)濃度對照品溶液的峰面積比較，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，3種濃度的平均回收率分別為99.82%、98.99%、97.45%，RSD值分別為1.82%、1.91%、1.55%，超濾膜對天麻素?zé)o特異性吸附。

3.3 血漿蛋白結(jié)合率測定 取2.2.3項(xiàng)下小鼠、大鼠、家兔不同濃度的超濾液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算其血漿蛋白結(jié)合率[10]，見表1。

式中：C超濾前為超濾前含藥物的PBS溶液的濃度；C超濾后為相應(yīng)血漿樣品超濾液的濃度。

表1 不同血漿的蛋白結(jié)合率測定結(jié)果（x± s ，n = 3）

由表1結(jié)果表明，天麻素與小鼠、大鼠、家兔血漿均屬于低強(qiáng)度結(jié)合，家兔的血漿蛋白結(jié)合率略高于小鼠和大鼠，但無顯著性差異，無濃度依賴性。

4 小結(jié)

4.1 測定方法的選擇 常用血漿蛋白結(jié)合率的測定方法有平衡透析法、微透析法、超濾法等[11-13]，由于平衡透析法和微透析法試驗(yàn)耗時較長、濃度稀釋、體積變化等影響因素較多，故本試驗(yàn)選用操作簡便、影響因素較少的超濾法。

4.2 溫育時間的選擇 預(yù)試驗(yàn)中，考察了天麻素與血漿蛋白結(jié)合的溫育時間[14]。在正常人體溫37 ℃下，分別考察溫育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時天麻素的血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果表明，溫育2.0 h時天麻素與血漿蛋白的結(jié)合已基本穩(wěn)定，故最終的溫育時間為2.0 h。

4.3 超濾條件的選擇 采用10%高氯酸溶液檢查血漿樣品超濾液中是否有蛋白，以不漏出蛋白且超濾液體積與超濾前總體積之比在0.3～0.6范圍內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)[15]，確定最終超濾時的離心條件為6 000 r/min離心20 min。

4.4 天麻素的血漿蛋白結(jié)合率 本文采用超濾法結(jié)合HPLC法測定天麻素與小鼠、大鼠、家兔的血漿蛋白結(jié)合率，結(jié)果表明，天麻素與不同種屬動物的血漿蛋白均屬于低強(qiáng)度結(jié)合，家兔的血漿蛋白結(jié)合率略高于小鼠和大鼠，但是無顯著性差異，且無濃度依賴性。故為天麻素的藥物臨床前研究提供了劑量和安全性的依據(jù)。