NGF及其受體在雄雞睪丸組織中的定位及表達

李麗芳，賈球鋒，喬 琳，張 晉 ，李嘉威 ，張瑞強

（1.山西農業大學信息學院，山西太谷030800；2.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

神經生長因子（Nerve Growth Factor，NGF）是大約在60 a前首次被發現可誘導神經生長的蛋白質，對產前感覺神經和交感神經的生長必不可少[1]。許多資料報道，NGF除具有對神經元的作用外，還具有多方面的生物學效應，目前也有研究表明，NGF還與阿爾茨海默病和頑固性疼痛有關[2]，其廣泛分布于神經系統、生殖系統、內分泌系統、循環系統和免疫系統等。而NGF發揮效應是通過NGFR（神經生長因子受體）介導的，已發現NGF有2種受體，Trk為高親和力受體，P75為低親和力受體。P75受體在細胞生殖及凋亡中有雙重作用[3-4]。研究發現，在雄性動物的生殖系統中NGF及NGFR均有不同程度的表達，它們可以通過自分泌和旁分泌途徑對生殖器官的生長、發育及功能起重要的調控作用[5]。通過對不同物種的研究發現，NGF的表達在物種間存在一定的差異性。有關NGF在生殖系統中的研究主要以哺乳動物為主[6-9]，禽類相關的研究內容報道較少。

本研究采用Western blot技術及免疫組織化學技術對雄雞睪丸組織NGF及其受體P75的定位及表達情況進行研究，探討NGF及P75蛋白在雄雞睪丸組織中的表達規律及其在雄性生殖系統機能調節中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 分別于14，20，24，35周齡時對山西省太谷縣回馬村一養雞場同批次飼養的雄雞采樣，每次取4只重復，共取16只。宰殺后取睪丸組織，一部分經液氮速凍處理后，暫存于-80℃冰箱，用于提取總蛋白；另取一部分立刻投入Bouins固定液中，用于組織切片的制作。

1.1.2 試劑 組織裂解液RIPA（含PMSF），購自北京Solarbio公司。一抗（多克隆兔抗NGF和P75抗體）、二抗，均購自北京博奧森生物技術有限公司。DAB試劑盒購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，ECL顯色液購自上海碧云天生物技術有限公司，其余為常規試劑。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白提取及Western blot鑒定 稱取組織樣品約0.1 g，加入液氮研磨成粉末，之后加入1 mL RIPA裂解液，冰上裂解約30 min，期間多次振蕩混勻，12 000 r/min，4℃離心5 min后取上清，吸取50 μL用微量蛋白測定儀測定蛋白含量。每孔加入約20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后再經100 mA，100 min冰浴作用將蛋白轉移至NC膜上，封閉液封閉2 h。加入兔抗NGF及P75蛋白抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。次日TBS-T洗膜3次，每次 8 min。二抗（1∶5 000）室溫孵育 2 h，TBS-T洗膜3次，每次8 min。最后用ECL顯色液顯色并拍照保存。

掃描NC膜，應用FluorChem Q SA軟件對結果進行分析，以β-actin為內參與目的比較進行半定量分析，計算公式如下。

1.2.2 免疫組織化學技術 取經Bouins固定的睪丸組織，石蠟包埋，切片脫蠟至水，PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min，滴加3%H2O2在室溫條件下孵育15 min，以消除組織中存在的內源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，用A液（正常山羊血清工作液）封閉后滴加一抗（均為1∶300），陰性對照用PBS緩沖液代替一抗，4℃過夜，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，再滴加B液（生物素標記的山羊抗兔IgG工作液），PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，滴加C液（辣根酶標記鏈霉卵白素工作液），PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min，DAB顯色，蘇木精復染，常規石蠟切片脫水、樹膠封片。顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 Western blot檢測結果分析

Western blot結果顯示，雄雞睪丸組織總蛋白中存在能與兔抗NGF和兔抗P75抗體發生免疫陽性反應的蛋白條帶，P75分子質量大小約為75 ku，NGF分子質量大小約為26 ku（圖1）。本試驗結果顯示，NGF及其受體在雄雞睪丸內不同發育階段均有表達，所用一抗特異性好。

通過FluorChem Q SA軟件分析灰度值，由圖2可知，NGF及P75受體蛋白含量隨日齡增加呈遞增趨勢，但P75受體蛋白增加的階段性不如NGF明顯，且在35周齡左右接近峰值。

2.2 免疫組織化學檢測結果分析

NGF及其受體P75免疫組織化學染色結果如圖3所示，雄雞睪丸組織的曲細精管在性成熟前以圓筒形為主，性成熟后以橢圓型為主。支持細胞呈不規則形，曲細精管與間質細胞的聯系并不緊密，且間質細胞不發達。NGF及P75蛋白在各發育階段均有陽性反應，且均勻分布于核周細胞質中，對照組未觀察到陽性細胞。

14周齡雄雞睪丸組織內曲細精管腔不明顯，主要為精原細胞、支持細胞及少量間質細胞所構成。精原細胞大多成群排列，精原細胞和支持細胞的界限不明顯。NGF及P75蛋白特異性免疫產物主要集中在支持細胞和精原細胞，間質細胞含量較少。

20周齡開始隨著睪丸組織發育，曲細精管直徑增加，開始出現空腔。NGF及P75蛋白特異性免疫產物主要集中在各級生精細胞、支持細胞及間質細胞。

從20周齡至24周齡基本達到性成熟，并在35周齡達到最高峰。睪丸組織內曲細精管管腔已十分明顯，可見各級精細胞及成熟精子，精原細胞呈多層排列。NGF及P75蛋白特異性免疫產物在各細胞中均可見。

對照組試驗切片中NGF及P75蛋白免疫反應均為陰性。

3 討論

近年來，對NGF在非神經組織內的研究越來越多，NGF在生殖系統的作用也逐漸被揭示出來。BRIAN等[10]在1991年提出，睪丸不僅具有生精功能，同時也具有內分泌功能。它能夠通過產生肽類生長因子，以自分泌和旁分泌的作用方式，參與細胞的生長、發育與成熟過程，且其中NGF的潛在作用可能是介導細胞間的相互作用。同時附睪也具有內分泌功能，可通過分泌雄激素對儲存的精子的成熟和獲能起重要作用。研究發現，染氟可使大鼠附睪的內部結構出現不同程度的損傷，從而影響其功能[11]。吳建云等[12]在對大鼠睪丸組織中NGF的表達研究中發現，睪丸間質細胞能夠分泌NGF，并通過與間質細胞、生精細胞上的受體相結合，對睪丸的發育、組織形態的完善、生殖細胞的發生等起調節作用。

RUSSO等[13]于1999年在對NGF和其受體在小鼠胚胎期和發育過程（1，5，10，20 d）中睪丸組織的表達的動態觀察中發現，NGF及其受體的主要表達部位會隨日齡增加發生變化，早期主要存在于支持細胞，后期則存在于間質細胞、管周樣細胞。LI等[6]對大鼠的研究表明，NGF主要位于間質細胞及初級和次級精母細胞，在輸精管的上皮細胞和促性腺的上皮細胞中也存在著表達，而在成熟精子和支持細胞中呈陰性反應。CUPP等[14]研究了胚胎期和出生后0～5 d的大鼠睪丸組織中的NGF及其受體的表達情況，結果表明，早期NGF及其受體主要存在于支持細胞，而后期則存在于間質細胞和各級生精細胞中。這些研究表明，NGF及其受體在睪丸發育的不同階段均有表達，但表達部位有所不同。本試驗結果顯示，在睪丸發育階段表達產物主要集中在支持細胞，少量見于精原細胞及間質細胞，隨著雞性成熟的完成，NGF及其受體的表達產物主要見于支持細胞、精原細胞、各級精母細胞及精子中，間質細胞中含量較少，這可能與雞的睪丸間質細胞不發達有關。

LI等[6]通過免疫組織化學方法發現，在大鼠睪丸的間質細胞、初級精母細胞與粗線期精子細胞中都有NGF的表達，這與對日本猴[7]和人類[8]的研究結果是相近的。但對日本猴的研究還發現，NGF在睪丸的支持細胞也有表達。咸華等[15]采用RT-PCR技術對出生后 1，7，14，28，56 d 小鼠睪丸組織中NGF mRNA的表達量進行了研究，結果表明，出生后 1，7，14，28，56 d 的小鼠睪丸組織內均有 NGF mRNA的表達，且7d的表達量最高。胡永婷等[16]在對大鼠睪丸組織中NGF mRNA的研究中發現，NGF mRNA的表達量在21 d前呈上升趨勢，21 d達到峰值后逐漸下降至成年時并維持在一定水平。李麗芳等[17]采用實時熒光定量PCR技術對雄雞睪丸組織NGF mRNA的表達研究顯示，NGF mRNA在性成熟發育期（20～24周齡）雄雞睪丸組織中的表達量隨日齡增加呈上升趨勢，成年期（35周齡）有所下降。通過以上這些研究可以發現，NGF的表達在物種間存在一定的差異性。而在本試驗中，NGF及P75的蛋白表達量隨日齡增加而升高，且在35周齡基本達到峰值。

本研究以散養雄性土雞為對象，分析了NGF及P75在睪丸組織中的定位和表達，所得結果為分析其與睪丸組織的生長發育、性激素的分泌、精子的產生等生理學過程的關系提供了依據，為禽類生殖生理學研究奠定了重要的理論基礎，有助于闡明其在禽類生殖發育中發揮調節作用的分子機理。