添加GSH對氟中毒小鼠腎臟SOD和CAT活性的影響

張慧慧，李 瑞，王 婧，王曉菲，孫子龍

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

氟是一種反應性能極高的鹵族化學元素，也是人畜生長必不可少的微量元素，主要以氟化物的形式廣泛存在于自然界中[1]。如果大量的氟被攝入機體后，則會引起氟中毒。有研究顯示，氟中毒除造成牙齒、骨骼等結構的毒副作用外，同時還可以造成腦、肝腎、肺等軟組織的損害[2-3]。

腎臟是氟排泄的主要器官[4]，因此，氟中毒對腎臟的損害作用是多方面的。氟中毒會對腎臟組織結構造成一定的破壞，改變腎臟組織中酶的活性與含量，對腎臟功能指標和離子代謝也會產生一定影響[5]。氟中毒可引起脂質過氧化作用增強，抗氧化酶活力受到抑制，造成腎氧化與抗氧化防御機制的失衡，誘發腎臟的過氧化損傷，也可誘導細胞凋亡，引起自由基損害，改變腎酶活性，導致體內鈣代謝平衡紊亂[6]。谷胱甘肽抗氧化系統是機體抗氧化體系的重要組成部分，主要由還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、谷胱甘肽硫轉移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（GR）構成，其對有害物質引起的氧化損傷具有防御作用[7]。當生物有機體受到過氧化物損傷時，GSH可加快對過氧化物的清除，減輕組織細胞的氧化損傷，維持機體抗氧化防御能力[8]。因此，在此基礎上探討添加GSH對氟中毒小鼠腎臟損傷的緩解作用。

本試驗建立NaF＋GSH模型，研究氟中毒對小鼠腎臟SOD和CAT活性的影響，以及添加GSH的緩解作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 本試驗所選取的動物為3周齡SPF級雄性ICR小鼠，共50只，體質量為20～25 g，購自北京海淀興旺實驗動物養殖場。小鼠飼料為標準的顆粒飼料，由中國輻射防護研究院提供。

1.1.2 藥品 氟化鈉（NaF），購自天津市化學試劑三廠；谷胱甘肽（GSH），購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 試劑 總蛋白定量測定試劑盒（BCA法）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；雙蒸水，冰醋酸。

1.1.4 主要儀器 高速勻漿儀，購自德國IKA公司；37℃恒溫水浴鍋，購自世安科興科技開發有限公司；旋渦混合器，購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；722s可見分光光度計，購自上海菁華科技儀器有限公司；Therm Scientific VarioskanRFlash，購自美國ThermoForma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物模型的建立 氟中毒＋還原型谷胱甘肽模型：50只雄性小鼠適應性飼養7 d后，隨機分成5組，每組10只，分籠飼養。對照組飲用蒸餾水，其余4組為染氟組，供給含100 mg/L NaF的純化水。飼喂30 d后，在100 mg/L NaF組隨機選取3組分成100mg/LNaF＋200mg/kgGSH組、100 mg/L NaF＋400mg/kgGSH組和100 mg/LNaF＋800 mg/kg GSH組，這3組小鼠自分組起，每日固定時間，按200，400，800 mg/kg GSH 的劑量進行小鼠灌胃，同時飲用含100 mg/L NaF純化水，共30 d。

小鼠飼養期間，鼠房保持環境干凈整潔，溫度20℃左右，濕度適宜，每日按時飼喂飼料，各組小鼠自由飲水、采食。每10 d更換一次鋪墊飼料，并對鼠籠進行充分消毒。

1.2.2 小鼠生長狀態的觀察 飼養期間，每日觀察并記錄各組小鼠的活動情況和精神狀態。

1.2.3 腎臟的采集 氟中毒＋還原型谷胱甘肽組小鼠飼養結束后，脫頸椎方式處死小鼠，摘取小鼠腎臟組織，使用高壓消毒過的試驗器械，盡可能剔除腎臟表面其他雜物。試驗組織暫時放在液氮中保存，之后放入超低溫冰箱（-80℃）長期保存。

1.2.4 小鼠腎臟總蛋白濃度、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的測定 按照南京建成試劑盒說明書制備各項指標的腎臟勻漿液。按說明書將腎臟組織勻漿后采用化學BCA法測定總蛋白濃度，然后采用分光光度計檢測SOD，酶標儀檢測CAT。試驗過程中用到的各種型號槍頭、EP管等耗材及試驗儀器剪子、鑷子等均需高溫高壓、干燥處理，以減少污染。

1.3 數據分析

試驗結果應用Graphpad Prism5統計分析軟件的ANOVA方法進行數據分析，事后檢驗采用Newman-keuls，結果以柱狀圖表示。

2 結果與分析

2.1 氟對小鼠生長狀態的影響

在飼養期間，對照組小鼠的食欲旺盛，飲水正常，體毛光滑，反應敏捷。而染氟組小鼠的被毛無光澤，躁動不安，喜歡撕咬同伴背部及尾部皮毛。

2.2 氟中毒小鼠腎臟總蛋白比較分析

與對照組相比，100 mg/L NaF組總蛋白質量濃度降低；與100 mg/L NaF組相比，添加GSH組總蛋白質量濃度逐漸升高，但均無顯著性變化（圖1）。

2.3 氟中毒小鼠腎臟SOD活性比較分析

從圖2可以看出，與對照組相比，100 mg/L NaF組的SOD活性降低，差異顯著；與100 mg/L NaF組相比，添加GSH組的SOD活性隨著GSH含量增加而逐漸升高，400 mg/kg GSH組和800 mg/kg GSH組SOD活性升高，且差異達極顯著。

2.4 氟中毒小鼠腎臟CAT活性比較分析

從圖3可以看出，與對照組相比，100 mg/L NaF組的CAT活性降低；與100 mg/L NaF組相比，添加GSH組的CAT活性隨著GSH含量增加而呈現一定程度的升高，但均沒有顯著性變化。

3 討論

3.1 氟中毒對腎臟的損傷作用

氟中毒是一種慢性全身性疾病，長時間、過量的氟攝入會導致機體組織和臟器的損傷[9]。腎是機體的排泄器官，機體攝入的氟有50%以上經腎臟由尿排出體外，所以，腎成為氟中毒損害的主要靶器官之一[3]。氟能妨礙許多酶的合成，抑制酶的活性。酶活性降低，自由基作用增強，導致機體受到損傷[10]。自由基是某些化學物質通過熱解、光解、輻射分解金屬離子的偶聯反應，它在體內可損傷機體各系統[11]，而酶又可清除自由基。氟化物損傷機體各系統，引起細胞膜滲透和膜結合酶的變化，氟自由基攻擊不飽和脂肪酸共價鍵處，造成脂質過氧化反應的產生[12]。

3.2GSH與SOD和CAT活性相關性分析

GSH是機體內重要的非酶性抗氧化物，它可以清除體內的過氧化氫和脂質過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷，是生物體內重要的活性氧自由基清除劑[13-14]，所以，添加谷胱甘肽能夠緩解氟中毒對小鼠腎臟的損傷。SOD和CAT是機體抗氧化體系的關鍵酶蛋白[15-16]。

SOD是生物抗氧化酶類的重要成員，也是一種金屬酶，其性質不僅取決于蛋白質部分，而且還取決于結合到活性部位的金屬離子，在機體內普遍存在，能去除超氧化物陰離子自由基，催化超氧陰離子發生歧化反應轉變為過氧化氫[17]，從而減少脂質過氧化作用引發劑的生成，以減弱脂質過氧化作用，清除并維持氧自由基的平衡[18]，防止生物體的損傷，因此，其被稱為生物體抗氧化系統的第一道防線。本研究表明，SOD在氟攝入后活性降低，添加GSH后其活性逐漸升高，并呈顯著性變化。證明了添加GSH后對氟中毒小鼠腎臟損傷有緩解作用。

CAT是一類能夠催化氧化還原反應的氧化還原酶，也是機體抗氧化酶體系的一個重要組成部分，它可以將代謝過程以及歧化反應所產生的副產品過氧化氫轉變為氧和水[19]，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受過氧化氫的毒害[20]，減輕氧化損傷，是生物防御體系的關鍵酶之一[21]。本試驗結果顯示，CAT在氟攝入后活性降低，添加GSH后活性升高，但沒有顯著性變化，可能是受到劑量、試驗動物和作用時間等因素的影響。因此，試驗證明SOD和CAT均具有解毒作用，添加GSH后可以緩解氟中毒小鼠腎臟的損傷。

4 結論

本試驗研究表明，氟中毒對腎功能造成了一定的損傷，攝入氟之后SOD和CAT活性降低，添加GSH后活性都有所升高，說明添加GSH后確實能夠緩解氟中毒對小鼠腎臟的損傷作用。