正交試驗—多指標歸一化法優化鳳丹皮水提工藝

王培　趙宏蘇　吳德玲　許鳳清　張偉　龍全江　方成武

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0361-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.17

摘 要 目的：優化鳳丹皮水提工藝。方法：采用L9（34）正交試驗設計，以鳳丹皮中8個成分沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚的峰面積百分比和浸膏率經歸一化法后的綜合評分為考察指標，對鳳丹皮水提工藝的藥材浸泡時間、料液比、提取時間、提取次數進行優化，并進行驗證試驗。結果：最優水提工藝為加20倍水，浸泡藥材1 h，提取2次、每次2 h。驗證試驗結果中，3次試驗的綜合評分分別為65.98、68.85、69.25，各指標的RSD均小于5%（n=3）。結論：建立的綜合評分方法能較全面地反映鳳丹皮的相對有效成分含量，以此優化得到的提取工藝合理、可行。

關鍵詞 鳳丹皮；多指標；歸一化法；正交試驗；提取工藝；優化

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize water extraction technology of Feng-Moutan Cortex. METHODS： L9（34） orthogonal design was used to optimize soaking time， solid-liquid ratio， extraction time and extraction times in water extraction technology of Feng-Moutan Cortex using comprehensive scores for the peak area percentage and extract yield of 8 ingredients in Feng-Moutan Cortex as gallic acid， paeoniflorin， catechin， paeoniflorin， benzoic acid， benzoyloxypaeoniflorin， benzoylpaeoniflorin and paeonol after normalization as indexes. Verification test was conducted. RESULTS： The optimal water extraction technology was that 20-fold water， soaking for 1 h， extracting twice， 2 h each time. Results of verification test showed that comprehensive scores of 3 times of tests were 65.98， 68.85 and 69.25， respectively. RSDs of each index were lower than 5% （n=3）. CONCLUSIONS： Established comprehensive scoring method can reflect the relative contents of effective components in Feng-Moutan Cortex comprehen- sively， so that optimized extraction technology is reasonable and feasible.

KEYWORDS Feng-Moutan Cortex； Multiple-index； Normalization method； Orthogonal test； Extraction technology； Optimization

牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀之功效，主要用于溫毒發斑、吐血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經閉痛經等癥狀[1]。牡丹皮在我國主要分布于安徽銅陵、南陵、亳州、青陽，重慶墊江，甘肅榆中以及四川、山東、陜西、湖南等地。傳統認為銅陵鳳凰山、南陵丫山為丹皮的道地產區，該產區牡丹皮被稱為鳳丹皮[2]。本研究以道地藥材鳳丹皮為研究對象，采用正交試驗設計鳳丹皮水提工藝，選定沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚等8個成分的面積百分比和浸膏率為評價指標[3]，采用峰面積歸一化法對多指標的正交試驗結果進行評分，篩選最優水提工藝。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜系統，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower3 色譜工作站（美國Waters公司）；PALL Cascada II.I超純水一體化系統[頗爾過濾器（北京）有限公司]；WL-100打粉機（瑞安市威力制藥機械廠）；EX125DZHW十萬分之一天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海光都儀器設備有限公司）；HH數顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

鳳丹皮于2016年10月采自銅陵鳳凰山，經安徽中醫藥大學藥學院劉守金教授鑒定為毛茛科植物4年生牡丹的根皮；沒食子酸（批號：GZDD-0128）、兒茶素（批號：GZDD-0073）、芍藥苷（批號：0736-200015）、苯甲酰氧化芍藥苷（批號：GZDD-1655）、苯甲酸（批號：GZDD- 0182）、苯甲酰芍藥苷（批號：GZDD-0758）對照品均購于貴州迪大生物科技有限責任公司，純度均大于98%；氧化芍藥苷對照品（批號：16021505，純度：99.93%）由北京恒元啟天化工技術研究所提供；丹皮酚對照品（安徽中醫藥大學天然藥物化學實驗室制，批號：2016-11，純度：>99%，經峰面積歸一化法計算）；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 藥材的前處理

鳳丹皮藥材采集后清洗去除泥沙，除去細根，剝取根皮，曬干，于48 ℃以下干燥[4]，粉碎，過4號篩備用。

2.2 多成分峰面積百分比測定方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定各對照品沒食子酸4.02 mg、氧化芍藥苷5.05 mg、兒茶素1.47 mg、芍藥苷5.53 mg、苯甲酸2.93 mg、苯甲酰氧化芍藥苷1.76 mg、苯甲酰芍藥苷1.01 mg、丹皮酚2.47 mg，分別加入50%甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，制成對照品貯備液。精密吸取各對照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，制成上述8種成分質量濃度分別為40.2、50.5、28.4、110.6、58.6、35.2、22.0、123.5 ?g/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取鳳丹皮藥材粉末10 g，精密稱定9份，根據正交試驗進行回流提取，每次提取后過濾，合并濾液，定容至100 mL量瓶中。吸取5 mL，用甲醇定容至25 mL量瓶中，搖勻，用0.22 ?m微孔濾膜濾過，即得各提取液的供試品溶液。另量取提取液50 mL經濃縮后真空干燥至恒質量，稱取浸膏量，供測定浸膏率用。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相：乙腈（A）-0.02%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，8～15%A；1～8 min，15%～18%A；8～10 min，18%～30%A；10～15 min，30%～35%A；15～20 min，35%～85%A）；流速：0.15 mL/min；進樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm。按上述色譜條件，取“2.2.1”“2.2.2”項下混合對照品溶液和供試品溶液（正交試驗中7號）進樣分析，結果各成分色譜峰及與相鄰峰間的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.2.4 精密度試驗 取鳳丹皮10 g，精密稱定。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，重復進樣6次，記錄色譜圖。結果，各成分峰面積的RSD均小于2.75%（n=6），表明本試驗精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 取同批鳳丹皮藥材6份，每份10 g。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。結果，各成分峰面積的RSD均小于3.03%（n=6），表明本試驗重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液（正交試驗7號），分別在放置0、2、4、8、10、12、24 h進樣測定。結果，各成分峰面積的RSD均小于2.33%（n=7），表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3 正交試驗鳳丹皮優化水提工藝

2.3.1 因素與水平 采用L9（34）正交試驗對鳳丹皮水提工藝進行優化[5-6]。經前期預試驗后，選擇水提工藝的4個影響因素：藥材浸泡時間（A，h）、料液比（B，g/mL）、提取時間（C，h）及提取次數（D）進行考察，建立4因素3水平表，詳見表1。

2.3.2 指標計算 將8個成分峰面積百分比（各成分峰面積占有效成分總峰面積的百分比）的權重系數分別設定為10，浸膏率權重系數設定為20，各項指標通過百分制評價[7-8]，歸一化處理后，得到綜合評分（Pj）。歸一化方程[9]為：Rij=（Fij-Fimin）/（Fimax-Fimin）。式中，Rij為第i個指標、第j次試驗的峰面積百分比歸一化值；Fij為第i個指標、第j次試驗峰面積百分比；Fimax、Fimin 為第i個指標峰面積百分比的最大值和最小值；i為評價指標，i=1、2、3…… 8，j為試驗次數，j=1、2、3……9。Ej=（Nj-Njmin）/（Njmax-Njmin），式中Ej為浸膏率的歸一化值，Nj表示第j次試驗中的浸膏率。Pj=10× [∑][i=1][j=8]Rij+20×Ej。

2.3.3 試驗方案與結果 選擇L9（34）正交試驗，采用多指標歸一化-加權法對數據進行處理，各試驗中8個成分峰面積百分比及浸膏率測定結果見表2，正交試驗方案及綜合評分結果見表3，方差分析結果見表4。

由表3、表4可見，各因素影響大小依次為B>C>A>D，即料液比>提取時間>藥材浸泡時間>提取次數。方差分析結果顯示，料液比在鳳丹皮提取過程中有顯著影響。由結果來看，雖以A2B2C3D3為最優組合，但D因素的第2、3水平之間的差距較小，即增加提取次數也不會大幅度地提高指標得分，反而只會增加能耗、浪費時間，故從經濟環保、節約成本的方面考慮，最終確定鳳丹皮的最優水提工藝為A2B2C3D2，即藥材浸泡1 h，加入20倍體積的水，提取2次、每次2 h。

2.4 驗證試驗

稱取鳳丹皮藥材3份，每份精密稱定100 g，置于圓底燒瓶中，加入2 L純水，浸泡1 h，加熱回流提取2次，每次2 h。結果，3次試驗8個成分峰面積百分比及浸膏率的RSD均小于5%（n=3），表明優化的水提工藝可行、穩定，結果見表5。

3 討論

鳳丹皮中含有多種化學成分，其主要化學成分為酚及酚苷類、單萜及其苷類、有機酸類、黃酮類等[10-11]。其中丹皮酚屬于酚及酚苷類，芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、苯甲酰氧化芍藥苷屬于單萜及其苷類，沒食子酸、苯甲酸屬于有機酸類，兒茶素屬于黃酮類。藥理研究發現：酚及酚苷類中的丹皮酚具有降血糖、抗炎、抗過敏及免疫調節等作用，單萜及其苷類中的芍藥苷具有抗血小板聚集、降血壓、調節血脂、鎮靜、鎮痛、抗炎等作用。有機酸類成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[12-13]，黃酮類成分具有抑制酪氨酸酶、高級糖化物終末產物（AGES）的產生等作用[14]。目前在牡丹皮提取工藝研究中，有的選取丹皮總酚作為指標性成分，有的選取總苷單體作為指標性成分，有的選取總黃酮作為指標性成分等[15-17]。以上試驗中提取工藝的優化在指標選擇上都存在一定局限性，故筆者將具有明確藥理活性的酚及酚苷類成分、單萜及其苷類成分、有機酸類成分、黃酮類成分同時作為優選鳳丹皮提取工藝的評價指標，并結合浸膏率，可在一定程度上保證鳳丹皮提取工藝的合理性，并且能夠較全面地反映藥材的質量，使其在臨床使用時具有更好的藥物作用效果。

本試驗以鳳丹皮中8個活性成分和浸膏率為考察指標，優化水提工藝，有利于兼顧各指標的綜合效應，符合中藥化學成分復雜的特點。同時為減少8個成分含量測定工作的煩瑣，運用多指標歸一化法對數據進行處理并建立了正交試驗評價指標公式。本試驗建立的提取工藝方法簡單、快速，可為中藥有效成分的提取評價提供一定的參考。

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（收稿日期：2017-06-07 修回日期：2017-11-06）

（編輯：劉 萍）