鹽霉素納米結構脂質載體的制備及處方優化

韓翠艷　金珊珊　王曉麗　簡白羽　隋小宇　曹立新

中圖分類號 R943 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0317-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.07

摘 要 目的：制備鹽霉素納米結構脂質載體（Sal-NLCs）并優化處方。方法：采用熔融乳化-低溫固化法制備Sal-NLCs。采用星點設計-響應面法，以粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量為評價指標，優化處方中Sal用量、油相中固態脂質雙硬脂酸甘油酯與液態脂質辛癸酸甘油酯的質量比、表面活性劑聚氧乙烯35蓖麻油（EL）與聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯（HS15）的質量比及聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（P40）的用量。考察所制Sal-NLCs的外觀形態、粒徑、多分散指數（PDI）、Zeta電位、包封率、載藥量和體外釋藥機制。結果：最優處方為Sal 0.86 mg、雙硬脂酸甘油酯40.70 mg、辛癸酸甘油酯11.30 mg、EL 44.05 mg，HS15 7.95 mg、P40 3.8 mg；所制Sal-NLCs呈類圓形、分布均勻，粒徑為（81.81±2.60）nm、PDI為0.183±0.042、Zeta電位為（-24.9±3.4） mV、包封率為（94.35±1.50）%、載藥量為（1.47±0.04）%（n=5），24 h內累積釋放度達到（99.81±3.90）%（n=3），釋放行為符合Higuchi模型，其中粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量與模型預測值的相對誤差均小于4%。結論：按優化處方成功制得具有緩釋效果的Sal-NLCs，且質量達到預期標準。

關鍵詞 鹽霉素；納米結構脂質載體；熔融乳化-低溫固化法；星點設計-響應面法；處方優化

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Salinomycin nanostructured lipid carriers（Sal-NLCs） and optimize its formulation. METHODS： Sal-NLCs was prepared by emulsion evaporation-low temperature solidification method. Using particle size， Zeta potential， encapsulation efficiency and drug loading as evaluation indexes， central composite design-response surface methodology was used to optimize the amount of Sal， the ratio of solid lipid glyceryl bisstearate to liquid lipid glyceryl octanoate in oil phase， ratio of surface active agent polyoxyethylene 35 castor oil （EL） to polyethylene glycol-15-hydroxy stearate （HS 15）， the amount of polyoxyethylene （40） stearate （P40）. The morphology， particle size， polydispersity index （PDI）， Zeta potential， encapsulation efficiency， drug loading and in vitro release mechanism of Sal-NLCs were investigated. RESULTS： The optimal prescription was as follows as Sal 0.86 mg， glyceryl bisstearate 40.70 mg， glyceryl octanoate 11.30 mg， EL 44.05 mg， HS15 7.95 mg， P40 3.8 mg. Prepared Sal-NLCs was round-like and dispersed evenly. The particle size， PDI， Zeta potential， encapsulation efficiency and drug loading of prepared Sal-NLCs were（81.81±2.60） nm， 0.183±0.042，（-24.9±3.4） mV，（94.35±1.50）% and （1.47±0.04）% （n=5）， respectively. 24 h accumulative release rate was （99.81±3.90）% （n=3）. Drug release behavior was in line with Higuchi model， and relative error of particle size， Zeta-potential， encapsulation efficiency and drug loading to predicted value of model were all lower than 4%. CONCLUSIONS： Sal-NLCs with sustained-release effect is prepared successfully according to optimized formulation， and its quality meets the expected standard.

KEYWORDS Salinomycin； Nanostructured lipid carriers； Emulsion evaporation-low temperature solidification method； Central composite design-response surface methodology； Formulation optimization

鹽霉素（Salinomycin，Sal）是一種可以有效殺傷腫瘤干細胞的聚醚酯類跨膜離子載體抗生素，幾乎不溶于水[1]，且組織選擇性差，因此，如何改善Sal的溶解性、提高其靶向性、減小其毒副作用是一個亟待解決的問題。固體脂質體納米粒是以固態的天然或合成的類脂為載體的脂質納米粒，在類脂納米粒中引入液態的脂質材料后，可形成納米結構脂質載體（Nanostructrued lipid carries，NLCs）。NLCs可以改善藥物的溶解度，具有生物相容性好、存儲穩定、不易發生藥物泄漏、適宜工業化大批量生產等優點，在藥物緩控釋、靶向、透皮、黏膜給藥等領域具有廣泛的應用[2-3]。為了改善Sal的溶解性，本研究將Sal制成Sal-NLCs，并采用星點設計-響應面法（CCD-RSM）進行處方優化，還考察了所制Sal-NLCs的粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量等各項指標。

1 材料

1.1 儀器

Malvern Zetasizer Nano-ZS90納米粒徑電位分析儀（英國Malvern公司）；Eppendorf 5804R臺式高速大容量離心機（北京博儀恒業科技發展有限公司）；HT 7700透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.2 藥品與試劑

Sal原料藥（美國Cayman Chemical公司，批號：0443366-37，純度：≥90%）；雙硬脂酸甘油酯（法國Gattefosse公司）；辛癸酸甘油酯（馬來西亞KLK油脂化工集團）；聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯（HS15）、聚氧乙烯35蓖麻油（EL，德國Basf公司）；聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（P40，美國Sigma公司）；乙腈為色譜純，其余均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 Sal含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水-四氫呋喃-磷酸（85 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 0.1， V/V/V/V）；流速：1.5 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 專屬性試驗 精密稱取Sal原料藥適量，以甲醇為溶劑，制備成質量濃度為1 mg/mL的Sal溶液，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。另取不含Sal的空白NLCs，經乙腈破乳后，以3 000 r/min（離心半徑11.4 cm）離心20 min，取上清液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。色譜圖顯示，Sal的出峰時間為15.5 min，NLCs所用輔料對Sal的測定無干擾。

2.1.3 線性范圍考察 精密量取Sal溶液，按一定比例制備成10、50、70、150、300、500 μg/mL系列質量濃度的標準供試液，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程y=1 004.7x-11 554（R2=0.999 0），結果表明，Sal檢測質量濃度的線性范圍為10.08～504.00 μg/mL。

2.1.4 精密度與方法回收率試驗 取質量濃度為50、250、450 μg/mL的Sal溶液，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，每天進樣5次考察日內精密度；每日進樣1次，連續進樣5 d考察日間精密度；以實測值與真實值的比值考察方法回收率。結果顯示，50、250、450 μg/mL Sal溶液中Sal峰面積的日內RSD分別為2.36%、0.32%、0.18%（n=5），日間RSD分別為1.69%、0.29%、0.14%（n=3），方法回收率分別為99.89%、100.13%、101.13%（RSD=0.21%、1.00%、0.99%，n=3），均符合相關規定。

2.2 Sal-NLCs的制備

采用熔融乳化-低溫固化法制備Sal-NLCs。稱取處方量的Sal、雙硬脂酸甘油酯及辛癸酸甘油酯，80 ℃水浴熔融，作為油相；另稱取處方量表面活性劑HS15、EL和P40，溶于適量純化水中，作為水相，并加熱至相同溫度。在恒溫水浴磁力攪拌下，將油相緩慢加入水相中，繼續攪拌15 min后，迅速轉移至冰水浴中固化，經0.8、0.45、0.22 μm微孔濾膜依次過濾后，即得Sal-NLCs。

2.3 評價指標的測定

2.3.1 包封率和載藥量 采用超濾離心法測定包封率和載藥量[4]。取Sal-NLCs溶液置于超濾離心管（截留分子量為10 kDa）中，10 000 r/min（離心半徑11.4 cm）離心40 min，收集下清液，經甲醇稀釋后，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，代入回歸方程計算Sal含量，即游離藥物含量W游離。取Sal-NLCs溶液，置于離心管中，經乙腈破乳后，3 000 r/min（離心半徑11.4 cm）離心20 min，取上清液，進樣測定，計算Sal含量，即總藥物含量W總。按照下述公式計算Sal-NLCs的包封率（%）和載藥量（%），包封率=（W總-W游離）/W總×100%，載藥量=（W總-W游離）/W脂質×100%，式中W脂質為處方中液態脂質和固態脂質的總量[5]。

2.3.2 粒徑與Zeta電位 將Sal-NLCs用純化水稀釋50倍后，置于納米粒徑電位分析儀中測定粒徑、Zeta電位。

2.4 優化處方

2.4.1 星點試驗 前期單因素試驗結果表明，對Sal-NLCs質量有顯著影響的是油相雙硬脂酸甘油酯-辛癸酸甘油酯的比例、表面活性劑EL-HS15的比例和P40用量，其中脂質最佳總量為52.00 mg，EL和HS15最佳總量為52.00 mg。因此，選擇以粒徑（Y1）、Zeta電位（Y2）、包封率（Y3）、載藥量（Y4）為因變量，Sal用量（X1）、雙硬脂酸甘油酯-辛癸酸甘油酯用量比（X2）、EL-HS15用量比（X3）、P40用量（X4）為自變量，在粒徑<200 nm、Zeta電位絕對值>20 mV、包封率>70%、載藥量>1%的前提下，采用Design-Expert 8.0軟件，設計星點試驗方案[5-8]，自變量與水平見表1，星點試驗設計與結果見表2。

2.4.2 模型擬合 采用Design-Expert 8.0軟件，根據擬合優度（R）和置信度（P）對表2的數據結果進行數學模型預測，多元線性擬合，評價指標與各因素的函數關系如下：

Y1=110.75+2.26X1-16.86X2-1.15X3+24.47X4-1.44X1X2-2.27X1X3-2.95X1X4-0.97X2X3+2.92X2X4+0.86X3X4-6.86X12+1.02X22-3.42X32+4.95X42+0.95X1X2X3+1.65X1X2X4+2.17X1X3X4-2.23X2X3X4+4.72X12X2+1.40X12X3-26.12X12X4+1.93X1X22-0.96X1X2X3X4-14.20X12X22（R2=0.999 9，P<0.000 1）；

Y2=-27.17+0.15X1+2.00X2+0.70X3-0.50X4-0.036X1X2+0.16X1X3+0.23X1X4-0.54X2X3-0.076X2X4-0.35X3X4+0.97X12-0.058X22-0.058X32+0.52X42-0.049X1X2X3+0.011X1X2X4-0.19X1X3X4+0.036X2X3X4-1.05X12X2-3.13X12X3-1.61X12X4-0.63X1X22-0.051X1X2X3X4+4.01X12X22（R2=0.998 9，P<0.000 1）；

Y3=35.05-3.60X1+8.21X2-2.54X3-16.10X4+0.78X1X2+0.88X1X3+0.95X1X4-6.28X2X3+3.32X2X4+12.55X3X4+8.26X12+8.47X22+11.10X2X3X4-3.99X12X2+1.16X12X3+13.26X12X4+2.24X1X22+0.67X1X2X3X4-7.46X12X22（R2=1.000 0，P<0.0001）；

Y4=0.65+0.13X1+0.082X2-0.002 5X3-0.23X4+0.033X1X2-0.019X1X3-0.005 625X1X4-0.077X2X3+0.033X2X4+0.18X3X4+0.12X12+0.12X22+0.16X32+0.028X42-0.004 375X1X2X3-0.017X1X2X4+0.038X1X3X4-0.077X2-0.006 875X12X2-0.014X12X3+0.22X12X4-0.014X1X22-0.012X1X2X3X4-0.083X12X22（R2=1.000 0，P<0.000 1）。

上述多元線性擬合結果顯示，R2均大于0.9，P均小于0.01，數學模型擬合良好，預測數據可取[9-10]。

2.4.3 響應面優化 自變量與因變量的響應面圖見圖1（僅列出有顯著相關關系的圖，余圖略）。

由響應面圖可知，X1、X2、X3、X4對Y1、Y2、Y4均影響顯著，而只有X1和X2對Y3影響顯著。綜合考慮，Sal-NLCs最優處方中X1為0.86 mg，X2為3.6，X3為5.54，X4為3.8 mg，即Sal 0.86 mg，雙硬脂酸甘油酯40.70 mg，辛癸酸甘油酯11.30 mg，HS15 7.95 mg，EL 44.05 mg，P40 3.8 mg。

2.4.4 處方驗證 按照最優處方平行制備Sal-NLCs溶液5份，檢測其粒徑、Zeta電位、包封率和載藥量，結果見表3。

由表3結果可知，各指標測定結果與預測值的相對誤差均小于4.0%，說明預測得到的最優處方可靠。

2.5 Sal-NLCs制劑學性質考察

2.5.1 外觀形態 所制Sal-NLCs外觀澄清，呈淡藍色乳光。取所制Sal-NLCs，經純化水稀釋10倍后，滴加至銅網上，2%磷鎢酸染液染色，靜置數分鐘，干燥后轉移至透射電鏡下觀察其形態。結果表明，Sal-NLCs呈類圓形，均勻分布，無可見顆粒，Sal-NLCs透射電鏡圖見圖2。

2.5.2 粒徑與Zeta電位 檢測所制5批次的Sal-NLCs的粒徑、多分散指數（PDI）、Zeta電位，結果分別為（81.81±2.60） nm、（0.183±0.042）、（-24.9±3.4） mV（n=5）。粒徑與Zeta電位分布圖見圖3。

2.5.3 包封率與載藥量 檢測所制5批次的Sal-NLCs的包封率和載藥量，結果分別為（94.35±1.50）%和（1.47±0.04）%（n=5）。

2.5.4 體外釋藥行為 采用透析袋法對Sal-NLCs的體外釋藥行為進行考察。為滿足漏槽條件，使體系中藥物終濃度小于其飽和濃度的10%，在釋放介質磷酸鹽緩沖液（PBS）中加入了20%乙醇和6%十二烷基硫酸鈉（SDS）。具體操作為：取Sal-NLCs溶液1.0 mL于預先活化好的透析袋中，并置于50 mL釋放介質（pH 7.4）中。在（37±2） ℃、200 r/min條件下恒速攪拌，分別于0、1、2、3、4、7、11、13、23、24 h取2.5 mL，同時補加相同體積的釋放介質。將2.5 mL樣品置于旋轉蒸發儀中進行濃縮，1.0 mL 50%甲醇水溶液復溶，經0.45 μm的微孔濾膜處理后，測定藥物含量，繪制釋放曲線，以時間為橫坐標（x，h）累積釋放度為縱坐標（y，%）擬合體外釋放模型。Sal-NLCs體外釋藥曲線見圖4，體外釋藥模型擬合結果見表4。

由圖4和表4結果可知，Sal-NLCs的釋放初期存在突釋現象，可能是因為溶液中部分游離以及少量吸附在NLCs表面的藥物存在所致。24 h內，Sal-NLCs累積釋藥（99.81±3.90）%，體外釋藥行為符合Higuchi模型，具有緩釋效果。

3 討論

采用超濾離心法測定藥物包封率時，發現下清液中的藥物濃度遠遠高于其在純化水中的溶解度，考慮可能是處方中的乳化劑對Sal具有增溶作用所致。因此，在考察超濾膜對鹽霉素是否有吸附作用時，在游離藥物溶液中加入了50%甲醇，用以改善鹽霉素的溶解性，且超濾膜對該溶劑耐受。

在制備Sal-NLCs時，為實現最大藥物包載量，分別考察了鹽霉素在不同脂質材料中的溶解度。結果在固態脂質材料中雙硬脂酸甘油酯>單硬脂酸甘油酯，在液態脂質材料中辛癸酸甘油酯>大豆油，因此本研究處方分別選用雙硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯。本試驗也考察了不同表面活性劑HS15、EL、P40、蓖麻油聚烴氧酯35、聚山梨酯80對粒徑和Zeta電位的影響，結果合用兩種表面活性劑使用效果強于單一的表面活性劑，其中HS15與EL合用效果最佳，同時考慮到NLCs的“隱形”效果[11-13]，加入含有聚乙二醇（PEG）結構的P40，因此最終選用3種表面活性劑。

納米載體質量評價的主要指標是粒徑、電位、包封率和載藥量。有文獻報道，當Zeta電位的絕對值>20 mV時，納米粒溶液處于穩定狀態[13-15]。當粒徑<200 nm時，可以滲透并滯留在腫瘤部位[16]。因此，在篩選Sal-NLCs時，設定納米粒粒徑<200 nm、Zeta電位絕對值>20 mV。同時，將包封率和載藥量分別設定為80%和1%以上，以期達到有效治療濃度，避免游離Sal過多，殺傷正常細胞。

此外，筆者還研究了Sal-NLCs體外細胞試驗，結果表明Sal-NLCs對CD133（一種跨膜蛋白，腫瘤干細胞標志物）陽性的腫瘤干細胞的增殖抑制率明顯高于Sal，顯示了更強的細胞毒性，還進一步對Sal-NLCs進行了靶向修飾，相關研究將另文發表。

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（收稿日期：2017-08-30 修回日期：2017-11-02）

（編輯：鄒麗娟）