鹽酸丙卡特羅微生物限度方法學研究

馬云艷

摘要：根據《中國藥典》2015年版四部通則1105及1106非無菌產品微生物限度檢查方法要求，建立鹽酸丙卡特羅微生物限度檢查方法。方法采用加入沖洗液及薄膜過濾以消除抑菌性。結果表明各試驗菌的回收比值均在0.5～2之間，控制菌結果呈陽性。表明該方法可作為鹽酸丙卡特羅的常規微生物限度檢查方法。

關鍵詞：鹽酸丙卡特羅；薄膜過濾

鹽酸丙卡特羅屬于選擇性β2受體激動劑，對支氣管的β2受體具有高度選擇性，其支氣管擴張作用強而持久。本文討論其作為口服制劑的原料藥使用，根據《中國藥典》2015年版四部通則1105及1106非無菌產品微生物限度檢查方法要求，應進行需氧菌、霉菌及酵母菌總數測定及大腸埃希菌控制菌檢查，本次試驗對鹽酸丙卡特羅的需氧菌、霉菌及酵母菌計數及控制菌檢查分別進行討論。

1 儀器與試驗用品

1.1 試驗菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]

枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63501]

銅綠假單胞菌[CMCC（B） 10104]

白色念珠菌 [CMCC（F） 98001]

黑曲霉[CMCC（F） 98003]

1.2 培養基、稀釋液、沖洗液等

胰酪大豆胨瓊脂培養基

沙氏葡萄糖瓊脂培養基

PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

氯化鈉

胰酪大豆胨液體培養基

麥康凱液體培養基

麥康凱瓊脂培養基

聚山梨酯80

1.3儀器

生化培養箱

立式壓力蒸汽滅菌器

電熱恒溫鼓風干燥箱

Milliflex PLUS微生物過濾系統

1.4 樣品

鹽酸丙卡特羅

2微生物限度方法驗證試驗

2.1菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至胰酪大豆胨瓊脂培養基上，30～35℃培養18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，20～25℃培養2～3天，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，20～25℃培養5～7天，加入3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出轉移至空無菌試管作為原菌液，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2供試液的制備

取本品10g，加含0.1%聚山梨酯80的PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：10供試液。

2.3 需氧菌總數測定方法試驗

2.3.1 平皿法

（1）試驗組：取1：10供試液9.9ml，加入適量濃度的0.1ml枯草芽孢桿菌菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供試液，取0.1ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供試液，備用。

（2）菌液組：取適量濃度的0.1ml枯草芽孢桿菌菌液加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10ml，混勻，制成菌含量<100cfu/ml的菌懸液，吸取0.1ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基。同法制備含金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液，備用。

（3）供試品對照組：取試驗組項下1：10供試液0.1ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基。

2.3.2結論

通過培養，枯草芽孢桿菌回收比值小于0.5，說明本品對枯草芽孢桿菌有抑制作用，故不采用該法。

2.3.3 薄膜過濾法

（1）試驗組：采用薄膜過濾法，先用少量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，取1：10供試液1ml，加至100ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，再加入菌含量<100cfu/ml的枯草芽孢桿菌菌液，混勻后，全量倒入Milliflex PLUS微生物過濾系統的Microfil泵頭上的250ml濾杯內，抽濾完全，將濾膜用鑷子取下貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上。同法操作并依次加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。

（2）菌液組：取相應稀釋液替代供試液，同試驗組操作。按規定溫度培養并計數。

（3）供試品對照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗組操作。

（4） 陰性對照組：取相應稀釋液替代供試液，不加菌液，同試驗組操作。

2.4霉菌及酵母菌總數測定試驗

（1）試驗組：取1：10供試液9.9ml，加入適量濃度的0.1ml白色念珠菌菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供試液，取1ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基。同法制備含黑曲霉的供試液，備用。

（2）菌液組：取適量濃度的0.1ml白色念珠菌菌液加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至10ml，制成菌含量<100cfu/ml的菌懸液，吸取1ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基。同法制備含黑曲霉的菌懸液，備用。

（3）供試品對照組：取需氧菌試驗組項下1：10供試液1ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基。

2.5 結果

通過三次試驗結果表明，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液組菌落數的比值均在0.5～2范圍內，各試驗菌的回收試驗均符合《中國藥典》2015年版中的規定，可照所用的供試液制備方法和計數法進行需氧菌總數、霉菌和酵母總數計數。

3 控制菌檢查方法驗證試驗

3.1試驗菌種：

大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]

3.2菌液制備：

取大腸埃希菌的新鮮培養物接種至胰酪大豆胨瓊脂培養基中，30～35℃培養18～24小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數約為不大于100cfu的菌懸液。

3.3 驗證方法

（1）試驗組：取1：10的供試液10ml和規定量大腸埃希菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液體培養基中，培養18～24小時。

（2）陽性對照組：取規定量的大腸埃希菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液體培養基中，35℃培養18～24小時。

（3）陰性對照組：陰性對照組：取10ml稀釋液加入100ml的胰酪大豆胨液體培養基中，培養18～24小時。

（4）取試驗組、陽性對照組、陰性對照組上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42～44℃培養24～48小時。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時。

3.4結果

通過三次試驗表明，陽性對照組檢出大腸埃希菌；試驗組檢出大腸埃希菌，陰性對照組未檢出大腸埃希菌。結果符合《中國藥典》2015年版中的規定，方法可行，可照該方法進行大腸埃希菌控制菌試驗。

4 討論

鹽酸丙卡特羅微生物限度方法驗證中，需氧菌總數測定采用平皿法，對枯草芽孢桿菌有抑菌性，故加入沖洗液并采用薄膜過濾法進行試驗，而霉菌及酵母菌總數測定中供試品對白色念珠菌、黑曲霉無抑菌性，故采用平皿法進行試驗。取1：10供試液10ml至100ml胰酪大豆胨液體培養基，進行控制菌（大腸埃希菌）檢查。