HPLC法測定飼料中癸氧喹酯含量

宋亞偉 吳昊 劉發全 李東風 丁在亮 張莉 蔡東東

摘 要：建立了飼料中癸氧喹酯含量測定的高效液相色譜法。采用三氯甲烷-甲醇溶液提取飼料中癸氧喹酯，用Waters的HLB小柱進行純化，色譜柱為Waters公司Symmetry C18 （ 4.6 ×250mm ，5μm）；流動相為0.025mol/L氯化鈣溶液+甲醇（15∶85，V/V）；檢測波長265nm；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL。外標法定量。該方法在1-20μg/mL濃度范圍內，線性方程y=115.128216x+10.785087，呈現良好的線性關系（R2=0.99991），最低檢測濃度為1.0mg/kg。回收率均在85-100%之間。可用于飼料中癸氧喹酯的含量測定，該方法準確性強，重復性好，操作簡單。

關鍵詞：飼料 癸氧喹酯 含量 高效液相色譜法

Determination of Deoxyquinate in Feed by High Performance Liquid Chromatography Song Yawei，Wu Hao，Liu Faquan，Li Dongfeng，Ding Zailiang Abstract：The high performance liquid chromatography method was established to determine the content of deoxyquinate in feed. The samples were purified with HLB column（Waters Symmetry C18 4.6 ×250mm 5μm），using 0.025mol/L Calcium chloride solution and methanol（15：85，V/V） as mobile phases with flow rate 1.0mL/min ，detected by 265nm，taked 20μl ，detected by Diode array ultraviolet detector（DAD）. External standard method was used for quantification.The results showed that there was a good separation of deoxyquinate at 1-20μg/mL. The linear ranges were as follows：（ y=115.128216x+10.785087，R2=0.9991）.The detection limit was 1.0mg/kg . The recovery rate was 85-100%.Therefore， the method can be used for the determination of decoquinol in feed， which had high precision， high repeatability and easy Operation.

Key words：Feed；Deoxyquinate；Content；HPLC

癸氧喹酯（Decoquinate）是一種喹啉類抗球蟲藥，不但對球蟲的子孢子和滋養體有強烈的抑制作用，而且對發育中的第一代裂殖體有殺滅作用，對卵囊的孢子化過程亦有抑制作用[1]。《中華人民共和國獸藥典》中規定，癸氧喹酯在肉雞中休藥期為5天（中國獸藥典委員會，2015）。但是在飼料產品安全監管工作中發現超限量添加，不遵守休藥期規定，違反配伍禁忌等違規現象，因此亟待加強飼料中癸氧喹酯含量測定的研究。本文建立了高效液相色譜法測定飼料中癸氧喹酯含量，方法簡單快捷，定量范圍廣，可行性高，重現性號，靈敏度高，能夠滿足飼料質量安全檢測的要求。

1材料與方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 主要儀器設備

高效液相色譜儀（Agilent公司HP1100，配有二極管陣列紫外檢測器）；色譜柱（Waters公司Symmetry C18，4.6×250mm，5μm） ）；十萬分之一天平（德國賽多利斯BS21S，感量0.01mg，）；萬分之一天平（德國賽多利斯Bs224s，感量0.1mg）；離心機（日立CR22G）；超聲波清洗機；超純水器；螺口自動進樣瓶；數字可調瓶口分配器；單通道可調移液器；0.45?m微孔濾膜。

1.1.2 主要試劑

癸氧喹酯對照品（批號K0651211，含量99.7% 中國獸藥監察所）；甲醇（色譜純，4L/瓶，美國FISHER Chemical公司）；氯化鈣（分析純，上海試劑公司）；超純水（水質達18.25MΩ·cm，符合國家實驗室用水規格（GB6682-92））。

1.1.3 實驗飼料

本實驗選取的飼料由安徽新華飼料科技有限公司提供。

1.2 HPLC的色譜條件

二極管陣列紫外檢測器（DAD），檢測波長265nm；流速1.0ml/min；流動相為氯化鈣甲醇溶液+甲醇（15∶85，V/V）；Symmetry C18色譜柱（4.6×250mm 5μm）；自動進樣器，進樣量為20?l。

1.3實驗方法

1.3.1 試液配制

提取液：氯化鈣甲醇溶液（稱取氯化鈣10g，加甲醇1000ml，超聲溶解[2] ）；

流動相：氯化鈣甲醇溶液+甲醇（15∶85，V/V）；

儲備液與工作液：精確稱取20mg癸氧喹酯標準品（精確至0.00002 g）于200 mL容量瓶中，用氯化鈣甲醇溶液超聲溶解，冷卻，移取適量癸氧喹酯儲備溶液，用流動相稀釋成濃度分別為20、10、5.0、2.0、1.0μg/mL的標準工作溶液，現用現配。

1.3.2試樣制備

按GB/T14699.1的規定選取有代表性樣品200-500g，用四分法縮至100g，粉碎通過0.45mm孔徑篩，充分混勻，貯于磨口瓶中備用。

準確稱取5.0g配合飼料（濃縮飼料3.0g，預混合飼料1.0g）試樣，置于具塞錐形瓶中，精確加入氯化鈣甲醇溶液50ml，栓塞置于超聲波儀超聲提取30min。將試樣提取液倒入離心管中，3000r/min離心15min。取離心上清液用0.45?m濾膜過濾，濾液作為試樣溶液，上機待用。

1.3.3樣品定性

將樣品峰的保留時間與癸氧喹酯對照品出峰的保留時間相比較，從而對樣品中癸氧喹酯進行定性。

1.3.4樣品定量

采用外標法，數據處理系統可自動計算峰面積或根據具體峰型進行手動積分，將每個待測樣品的峰面積的平均值代入標準曲線，即可算出各自的濃度。

2 結果

2.1線性響應

將濃度分別為20、10、5.0、2.0、1.0μg/mL的癸氧喹酯標準工作溶液，供高效液相色譜分析，以各色譜峰峰面積為縱坐標，對照溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

從圖1和圖2可以看出，在1-20μg/mL濃度范圍內，呈現良好的線性關系，可以用于準確定量。

2.2 靈敏度

將標樣溶液經過逐級稀釋后進樣分析，最終得出該方法測定癸氧喹酯的最低檢測濃度為1.0mg/kg。

2.3 方法準確度和精密度

采用空白樣品添加法，對配合飼料分別添加濃度為10、20、30mg/kg進行復核實驗；對濃縮飼料添加濃度為20、40、80mg/kg進行復核實驗；對預混合飼料添加濃度為100、200、300mg/kg進行復核實驗。每種濃度5個樣品，重復3批次，求回收率、批內、批間變異系數。測定結果見表1至表3：

從上述表中數據可以看出，平均回收率均在85%以上，變異系數均小于5%，無論是各種濃度的回收率還是變異系數均滿足試驗要求，結果表明該方法穩定性好、重復性好，適用于飼料中癸氧喹酯的測定。

3 結論

通過對前處理條件和液相色譜條件的優化，建立了高效液相色譜法測定飼料中癸氧喹酯含量。該方法提取過程簡單，操作步驟較少、靈敏度高，穩定性、重現性好，能夠滿足飼料質量安全檢測的要求，加之，高效液相色譜法已成為應用非常廣泛的一種理化檢測手段，因此該方法能廣泛用于飼料中藥物成分的檢測。

參考文獻

[1] 周玉武，欒明娜，徐福亮，邵耀東.高效液相色譜法測定癸氧喹酯溶液的含量[J].中國獸藥雜志，2009，43（02）：32-34.

[2] 陳啟友，隆雪明，匡光偉，李艷平.高效液相色譜法測定飼料中癸氧喹酯的含量[J].中國飼料，2014（13）：37-38+42.

[3] WilliamsRB.The Mode of Action of Anticoccidial Quinolones （6-decyloxy-4 -hydroxyquinolone-3 -carboxylates） in Chickens[J] .IntJParasitol， 1997， 27：101 -111.

[4] WilliamsRB.TracingtheEmergenceofDrug-resistance in Coccidia（Eimeriaspp.） of Commercial Broiler Flocks Medicated with Decoquinate for the First Time in the United Kingdom[J] .VetParasitol， 2006， 135：1-14.

[5] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S] .二 O一五年版（一部）：附錄 43.

[6] SemanDH， HayekM G.HPLCAnalysis of Decoquinatein Feeds[J] .VetHumToxicol， 1986 ， 28（4）：325-327.

作者簡介：宋亞偉 男 1987年6月 職稱無 從事飼料質量安全檢測。