麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞IL-4/STAT6的研究

紀雯婷 胡京紅 于 雪 范盎然 任 紅 張蘭蘭 劉 敏

(北京中醫藥大學中醫學院,北京,100029)

麻黃細辛附子湯出自《傷寒論》,由麻黃、細辛、附子3味藥組成,臨床上常用于過敏性鼻炎、哮喘等疾病,收效顯著[1-3]。過敏性鼻炎為Th2優勢免疫應答的炎性反應[4-6],其發生與Th1/Th2的偏移密切相關。樹突狀細胞是重要的抗原提呈細胞,是免疫應答的啟動者,對Th細胞的分化密切相關。本文通過麻黃細辛附子湯對體外培養的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的干預研究,探討麻黃細辛附子湯治療過敏性鼻炎可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 C57BL/6雄性小鼠6周齡(20±5)g購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，全部小鼠在實驗前適應性飼養1周，飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心三級實驗室。實驗室溫度為(22±2)℃,濕度60%±5%,正常光照晝夜節律，維持安靜環境。

1.1.2 藥物 實驗選用的麻黃細辛附子湯出自《傷寒論》,麻黃、細辛、附子均購于北京中醫藥大學國醫堂。

1.1.3 試劑與儀器 CO2培養箱(Thermo Fisher scientific公司),離心機(Eppendorf公司),FCS、RPMI1640培養基為GBICO公司產品,GM-CSF、IL-4來自R&D公司,STAT6抗體購于Proteintech group公司,pSTAT6抗體來自abcam,Aimplex流式高通量檢測試劑盒(北京曠博生物技術股份有限公司),IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源樹突狀細胞的分離培養 C57BL/6J小鼠分離培養方法參考文獻[7-8]具體過程為:無菌條件下將小鼠股骨與脛骨分離,用1 mL注射器吸取RPMI-1640培養液從打孔處將骨髓沖入到干燥無菌培養皿中,收集骨髓細胞懸液,用紅細胞裂解液去除紅細胞后,將細胞重懸于含GM-CSF、IL-4的完全培養基中,密度為2×106個/mL,種于6孔板中,37 ℃、5% CO2條件下培養,隔天半換液,第6天時收集細胞備用。

1.2.2 藥物制備與篩選

1.2.2.1 麻黃細辛附子湯水提液制備 麻黃細辛附子湯,常用量為麻黃6 g、附子9 g、細辛3 g,用超純水按比例煎煮藥物1 h,使藥物終濃度達1 g/mL。12 000 r/min高速離心2次,10 min/次,收集上清,用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌并分裝,置-20 ℃保存備用。

1.2.2.2 麻黃細辛附子湯干預濃度的篩選 為了篩選適宜濃度的麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞，收集分選的樹突狀細胞,調整細胞濃度為5×105,吹打均勻,加入96孔板,每孔100 μL,10倍稀釋等比例稀釋1 g/mL的麻黃附子細辛湯水提液,按順序加入96空中,每個濃度的水提液設6個復孔,把細胞培養板放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h后,每孔加入10 μL CCK8試劑,酶標儀測試1次/0.5 h,并記錄數據。調整水提液濃度,重復實驗,發現10 mg/mL以內的麻黃細辛附子湯對樹突狀細胞的毒性很小,實驗選擇麻黃細辛附子湯干預濃度為2 mg/mL。

1.2.3 分組與給藥 本次實驗設計空白對照組(C組)與麻黃細辛附子湯干預組(M組)。其中，M組用麻黃細辛附子湯(2 mg/mL)干預24 h，C組用完全培養基對照培養24 h。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 樹突狀細胞IL-4、IL-5、IL-13的檢測 培養樹突狀細胞,按2×105種于24孔板,0.5 mL/孔。各組分別干預24 h后,收集各組細胞上清,按照Aimplex流式高通量多因子檢測技術檢測各組樹突狀細胞上清中IL-4、IL-13與IL-5的含量。

1.2.4.2 樹突狀細胞STAT6磷酸化的表達的檢測 培養樹突狀細胞,按5×106種于6孔板,2 mL/孔。各組分別干預24 h后,分別收集各組細胞,檢測STAT6與pSTAT6蛋白表達水平。

1.2.4.3 樹突狀細胞表達IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA 制備并分選樹突狀細胞,按2×105種于24孔板,0.5 mL/孔。各組分別干預24 h后,分別收集各組細胞,熒光定量PCR法檢測各組IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA表達。見表1。

2 結果

2.1 GM-CSF、IL-4成功誘導單核骨髓細胞成為樹突狀細胞 小鼠骨髓單核細胞經過細胞因子GM-CSF、IL-4的刺激下,成功誘導成為樹突狀細胞。顯微鏡下觀測可知,誘導的樹突狀細胞成葡萄串樣生長，細胞有毛刺樣突起。見圖1。

圖1 骨髓單核細胞誘導的樹突狀細胞(10倍目鏡×20倍物鏡)

2.2 麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞分泌IL-4與IL-13減少，而IL-5的含量沒有明顯變化 IL-4,IL-5以及IL-13均是典型的Th2型細胞因子。麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞24 h后,樹突狀細胞分泌IL-4的含量減少(P<0.05),分泌IL-13的含量也顯著降低(P<0.01),而IL-5的的含量與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2,圖2。可見,麻黃細辛附子湯可直接選擇性降低Th2相關的細胞因子,起到抑制過敏性炎性反應的作用。

2.3 麻黃細辛附子湯降低樹突狀細胞pSTAT6/STAT6比值 麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞24 h后,樹突狀細胞表達STAT6水平較空白對照組無差異,而pSTAT6的表達明顯降低(P<0.01),pSTAT6/STAT6比值降低(P<0.05)。見圖3、圖4。可見麻黃細辛附子湯能抑制STAT6磷酸化的水平從而阻止了T細胞Th2方向分化,起到調節Th1/Th2的失衡的作用。

表1 基因引物序列表

表2 各組樹突狀細胞IL-4、IL-5以及IL-13的表達情況

注:與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

表3 各組樹突狀細胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA的表達情況

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組樹突狀細胞IL-4、IL-5以及IL-13的表達情況

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 各組樹突狀細胞STAT6與pSTAT6的 Western-blot條帶比較,每組3個復孔

2.4 麻黃細辛附子湯降低樹突狀細胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA的表達 IL-4/STAT6通路是經典的Th2激活通路,通過細胞因子以及蛋白表達結果可知,麻黃細辛附子湯可降低IL-4水平,減少STAT6的磷酸化表達,我們進一步通過mRNA水平驗證麻黃細辛附子湯在樹突狀細胞上的抗炎機制。麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞24 h后,樹突狀細胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達均較空白對照組明顯降低(P<0.01)。見表3，圖5。可見,麻黃細辛附子湯可通過調控IL-4 mRNA,STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA發揮抗過敏的作用。

圖4 各組樹突狀細胞STAT6與pSTAT6蛋白表達情況

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖5 各組樹突狀細胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA表達比較

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

過敏性鼻炎作為TH2優勢免疫應答的炎性反應,其臨床特點為鼻癢、噴嚏、流涕、多遇寒而犯、遷延時長、反復發作,過敏性鼻炎貌似“外感”,實為“內傷”,通過傳統中醫思維的辨證分析,可以看出氣虛陽衰而外感寒邪是過敏性鼻炎關鍵病機[9-10]。麻黃細辛附子湯配伍嚴謹,將扶陽,散陽,通陽3個方面結合在一起,能扶正祛表,表里兼治,具有治療過敏性鼻炎的理論基礎[11-12]。

樹突狀細胞是抗原提呈細胞中攝取提呈抗原能力最強的成員,處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。樹突狀細胞能活化T細胞,分泌各種細胞因子,誘導并促進活化的T細胞分化,對Th分化起著重要的調控作用[13-14]。其中,樹突狀細胞分泌Th1型細胞因子如IL-12及IFN-γ等,誘導T細胞向T細胞向Th1方向分化[15]。同時,樹突狀細胞也可IL-4及IL-13等Th2型細胞因子,誘導T細胞向Th2方向偏移,造成過敏性疾病的發生[16]。麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞之后,引起IL-4與IL-13的分泌的減少,可起到調節Th2分化,改善過敏性疾病的潛質。但麻黃細辛附子湯對IL-5的含量影響不大,說明麻黃細辛附子湯可選擇性的影響Th2型細胞因子,對細胞因子上游具有特殊的調節作用。

信號傳導及轉錄激活因子(Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT)是一類具有信號傳導和轉錄活化的胞質蛋白家族,其家庭成員包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6[17-18]。STAT6可被IL-4、IL-13激活,活化后的STAT6進一步誘導IL-4、IL-13等轉錄因子表達,促進IL-4、IL-13等TH2型細胞因子的分泌,加重了TH2型炎性反應的發生[15-16,19-22]。因此,STAT6作為誘導Th2型變應性炎性反應關鍵轉錄因子,增加了變應性炎性反應的易感性,在許多過敏性疾病中都引起了研究者們重視。麻黃細辛附子湯干預樹突狀細胞后,STAT6磷酸化水平減少,從而阻止了T細胞Th2方向偏移,調節Th1/Th2的失衡,起到治療過敏性鼻炎的作用。

GATA-3 mRNA是Th2的特異性轉錄因子[23],作為STAT6的上游[24],激活后指導T細胞向Th2方向分化。麻黃細辛附子湯干預后樹突狀細胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達均下降,說明麻黃細辛附子湯對Th2經典通路IL-4/STAT6具有調控作用,可發揮調節過敏性鼻炎的作用。

總之,麻黃細辛附子湯減少IL-4、IL-13分泌,降低pSTAT6水平,降低IL-4 mRNA、STAT6 mRNA及GATAT-3 mRNA含量,負反饋樹突狀細胞IL-4/STAT6通路,使樹突狀細胞抑制T細胞Th2方向分化,調節Th1/Th2失衡,從而發揮治療過敏性鼻炎的作用。