基于腸道菌群探討保和丸對高脂飲食SD大鼠血脂的作用

李玉波 馬雪玲 李志更 賈海驊 梁 媛 郝改梅

(1 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京，100700； 2 北京中醫藥大學，北京，102446)

當前諸多研究顯示，長時間的高脂飲食可以長期而持續的改變腸道微生態[1-3]，腸道菌群失調可以引起脂代謝紊亂，導致高脂血癥[4-8]。而保和丸為消食劑，具有消食、導滯、和胃之功效，臨床上具有降低血脂的作用[9-11]。本研究采用高脂飲食長期喂養SD大鼠，觀察保和丸對其血脂和腸道菌群的影響，探討保和丸消食作用的現代生物學內涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠60只，SPF級，6周齡，體重范圍(250±10)g，購自北京維通利華生物技術有限公司，按照隨機數字表法將60只大鼠分成4組，即模型組、正常組、高脂飲食保和丸組(簡稱“高保組”)、正常飲食保和丸組(簡稱“正保組”)，每組15只，飼養高保組和模型組小鼠所需的高脂飼料也購買自北京維通利華生物技術有限公司。本研究經過中國中醫科學院中醫基礎理論研究所動物實驗倫理審查委員會的許可。

1.1.2 藥物 保和丸(水丸)(北京同仁堂科技發展股份有限公司，國藥準字Z11020921)，用法用量：1次1袋，2次/d。人(70 kg)與大鼠(0.2 kg)間藥量折算系數為6.3，若70 kg成人1次的用藥劑量為6 g，則轉化為0.25 kg大鼠1次的用藥量為0.135 g。將6 g保和丸溶于22 mL生理鹽水，得到0.27 g/mL的保和丸溶液，給藥體積為0.5 mL。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 高保組高脂飼料飼養，正保組普通飼料飼養，每組每只每日灌胃0.5 mL保和丸溶液2次，早8：00和晚20：00各1次；模型組大鼠高脂飼料飼養，正常組大鼠普通飼料飼養，每組每只每日灌胃0.5 mL生理鹽水2次，早8：00和晚20：00各1次。

1.2.2 收集樣本(糞便和血清) 實驗7周后取材，取材前1天7：00—23：00，間隔8 h收集4組大鼠的新鮮正常糞便，每次每組收集10個大小、質地相同的糞便，總共收集到120個樣本。取材當天用10%水合氯醛麻醉大鼠(根據每只大鼠的體重計算水合氯醛的使用量)，用一次性滅菌注射器腹主動脈取血2～3 mL，置于黃色采血管中離心，抽取血清，共計40個樣本。所有樣本均保存于-80 ℃恒溫冰箱。

1.2.3 糞便樣本DNA提取和PCR擴增 DNA快速提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，解凍糞便樣本后提取細菌DNA，吸取5 μL，通過紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度、分析DNA質量和數量。

PCR擴增的范圍為16SrDNA V3～V4可變區，引物由北京奧維森基因科技有限公司合成，序列為5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′/5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′。每個樣本3個重復，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測同一樣本的PCR混合產物，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司)回收PCR產物。

1.2.4 熒光定量、Miseq文庫構建和上機測序 此步驟由北京奧維森基因科技有限公司完成。

1.2.5 Elisa法檢測4組大鼠血脂水平 大鼠血脂4項指標具體為：血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，Elisa試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3 統計學方法 采用隨機區組方差分析大鼠血脂水平。采用R語言工具、抽平分析、秩和檢驗和Anosim相似性分析腸道細菌群落。

2 結果

2.1 4組大鼠飼養7周后血脂水平 模型組大鼠TC、TG、LDL-C含量明顯高于正常組，HDL-C含量明顯低于正常組。正保組大鼠TC、TG、LDL-C含量與正常組比較略有減少，HDL-C含量略有增加，差異無統計學意義(P>0.05)。高保組TC、TG、LDL-C含量與模型組比較明顯減少但仍高于正常組且差異有統計學意義(P<0.05)，HDL-C含量與模型組比較略有增加但差異無統計學意義(P>0.05)，但仍低于正常組且差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 腸道菌群多樣性分析

2.2.1 OTU分布 利用R語言工具統計分析(選用相似水平為97%)多個樣本中所共有和獨有的OTU數目，并繪制Venn圖。

圖1 OTU分布Venn圖不同的顏色代表不同的樣本，不同顏色的圓圈重疊的區域是為交集，即為重疊幾個顏色圈的相同OTU，相對于不重疊的部分則為獨有OTU

2.2.2 Alpha多樣性指數 抽平分析最低序列數的樣本數，4組大鼠腸道菌群多樣性指數。見表2。模型組腸道菌群多樣性明顯少于正常組，正保組與正常組腸道菌群數量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，高保組腸道菌群多樣性明顯多于模型組，但仍略低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.3 Anosim相似性分析結果 4組大鼠腸道菌群比較，組間差異有統計學意義(兩兩比較R值均大于0)，正常組與正保組大鼠腸道菌群比較，差異無統計學意義(P>0.05)，其余組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 4組大鼠飼養7周后血清血脂含量

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05

表2 Alpha多樣性指數

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05

表3 4組數據兩兩Anosim分析結果

注：R值的范圍為(-1，1)，R值大于0表明組間差異大于組內差異，R值小于0表明組內差異大于組間差異

圖2 群落結構分析

2.2.4 群落結構分析 經過Anosim相似性分析，將4組大鼠糞便樣本中存在差異的菌群進行了聚類，模型組菌群數量主要集中在放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等，與正常組比較存在顯著性差異，其中雙歧桿菌目、梭菌目、脫硫弧菌目、產氫細菌目菌群數量模型組明顯減少，其余明顯增加。正保組與正常組大鼠比較，其糞便樣本微生物菌群數量無明顯差異。高保組與正常組、正保組、模型組比較，糞便樣本微生物菌群數量差異有統計學意義。高保組與模型組比較能顯著增加綱雙歧桿菌目、梭菌目、脫硫弧菌目、產氫細菌目菌群數量，但仍低于正常組和正保組；同時能顯著減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數量，但仍高于正保組和正常組。具體如表4、圖2所示。

3 討論

從4組大鼠飼養7周后血清血脂含量來看，高保組能明顯降低TC、TG、LDL-C含量，說明保和丸具有一定的降低血脂的作用。中醫學臟象理論中的“脾”的內涵與現代醫學所指的消化系統相似，而腸道菌群在消化過程中發揮著重要的作用，本研究表明保和丸對高脂飲食大鼠的腸道菌群有明顯的改變，這或許是保和丸降低血脂的作用機制之一。

大多數中醫學者認為痰濁、瘀血為血脂異常的主要致病因素[12]。《臨證指南醫案》曰:“濕為重濁有質之邪，若從外而受者，皆由地中之氣升騰;從內而升者，皆由脾陽之不足。亦有外不受濕，而但從內生者，必其人膏粱酒醴過度，或嗜飲茶湯太多，或食生冷瓜果及甜膩之物”。又《世補齋醫書》云：“自逸病之不講，而世但知有勞病，不知有逸病。然而逸之為病，正不小也……安逸所生病與勞相反……夫逸之病，脾病也”。可見過逸少勞可致脾氣虛弱，水谷精微化生乏力，清濁混淆而發為高脂血癥。保和丸是消食劑的代表方，方中山楂消油膩肉積；神曲消酒食陳腐之積；萊菔子消面食痰濁之積；陳皮、半夏、茯苓理氣和胃，燥濕化痰；連翹散結清熱；諸藥合用，有消食導滯，理氣和胃之功。

人類的腸道菌群豐富度超過3 500種[15]，其中厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門占了95%以上[16]。

表4 OTU分類學綜合信息表(單位：個)

許多循證醫學研究指出：高脂血癥患者腸道菌群失衡，主要表現為雙歧桿菌等益生菌菌群數量減少，而大腸桿菌、幽門桿菌等菌群數量明顯增加[17-20]。本研究從腸道菌群分析結果來看，保和丸能促進雙歧桿菌目菌群數量，與文獻報道一致。同時保和丸還能促進梭菌目、脫硫弧菌目、產氫細菌目菌群數量，減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數量。

生物與環境的統一論是微生態學的基本觀點，這與中醫學基本觀點整體觀具有統一性，機體內的微生態系統，是正常微生物群與宿主和環境相互依賴、相互作用的統一有機整體[21]。具體而言，微生態學與中醫學都講究平衡與調節，微生態學有平衡理論對應中醫學有陰陽五行學說、微生態學有微生態調節論對應中醫學有扶正祛邪理論[22]，因此，腸道微生態原理可以成為中西醫結合的一個切入點。本研究結果顯示中醫經典古方保和丸具有一定的降低血脂的作用，并且一直以來臨床上無不良反應報道，因此在臨床降脂用藥方面，保和丸的應用或許能一定程度的減少他汀類等降脂化學藥物的使用從而減少他汀類藥物的不良反應。