CD44和CD133標記的PEG納米脂質體miR-425對結直腸癌干細胞的抑制及其機制研究

陳海云 廖洪利 杜希利

（喀什地區第一人民醫院檢驗科 新疆 喀什 844000）

腫瘤干細胞是一群腫瘤中少數具有干細胞性質的細胞，目前在白血病、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中發現了腫瘤干細胞[1]。miRNA分子在腫瘤發生發展過程中具有獨特的表達特征和生物學功能，miRNA在腫瘤的分子診斷和治療中具有廣發的應用前景[2]。近年來，研究者構建了多項非病毒納米載體，高效的將miRNA或者siRNA入胞，抑制靶基因表達，達到治療腫瘤的目的。已有研究證實[3]miR-425分子在肺癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌和腎癌等多種腫瘤中發揮著重要功能，在腫瘤的診斷、治療及預后中具有臨床應用價值。

1.資料與方法

1.1 一般資料

人結直腸癌HCT116細胞購自ATCC細胞庫；細胞培養基：DMEM培養基+10%胎牛血清；培養箱環境為：CO25%+37℃ 恒溫箱中養。DMEM培基、Real-Time PCR、購買自GIBCO公司；引物在上海生工合成，CD133和CD4抗體購自BD公司，PDL1抗體購自abcam公司。脂質體轉染試劑購自life公司，miR425慢病毒載體購自上海吉瑪生物公司。

設立空白組（PEG納米脂質體），對照組（轉染control）和實驗組（轉染miR425慢病毒載體）。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR（Real-Time qRT-PCR）

（1）冰上配制反應液

表1 Real-Time PCR反應體系

配置好后，混合均勻，并瞬時離心以沉降管內所有物質于管底。

（2）使用 CFX96 ? Real-Time PCR Detection System 擴增儀進行mRNA 的Real-time PCR 實驗

表2 Real-Time PCR反應程序

熔解曲線分析從 65℃開始到95℃停止，間隔 0.5℃。

（3）每個基因設置3個復空，實驗結果結算△△Ct值，之后進行統計學分析。

1.2.2 檢測PDL1表達水平 HCT116細胞轉染48h后，收集細胞，裂解，SDS-PAGE電泳分離，轉膜至PVDF膜上，4℃一抗孵育過夜，1*TBST洗滌3次/5 min，二抗37℃ 孵育1hours，1*TBST洗滌3次/10 min，電化學（ECL）發光試劑顯色，X射線膠片壓片后顯影、定影。

1.2.3 CCK8實驗

（1）將調整細胞密度為1000～10000/well，每孔加入200μL細胞懸液。

（2）放置于5%二氧化碳，37℃ 培養箱中培養。

（3）接種細胞后，到達每個時間點時，每孔加CCK8溶液20μL，孵育 4h。

（4）酶標儀450nm測定每個孔的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶活性測定

（1）24孔板中接種適量的細胞，待密度達到60%～80%轉染。PGl3-enhancer報告載體和pRL-TK載體質粒按照10：1的比例混勻，轉染細胞。

（2）轉染48h后，去除細胞培基，預冷的1×PBS，輕洗3次去除培養板內液體。

（3）用雙蒸水將5×PLB裂解液配置為1×PLB裂解液，100μL/孔1×PLB裂解液，將培養板-80℃冰箱靜置15分鐘，室溫下靜置裂解15分鐘，用移液器吹打細胞。

（4）每孔加入10μL裂解物，每組3個復孔，將96孔板放置于酶標檢測儀，加入LARII底物30μL，測得Luciferase 熒光素酶活性值。

（5）迅速加入Stop&Glo試劑30μL，測得pRL-TK海腎熒光素酶的熒光強度。

（6）相對熒光素酶活性=Luciferase熒光素酶活性值/pRL-TK海腎熒光素酶活性值的比值。

2.結果

2.1 腫瘤干細胞的干性

HCT116細胞轉染48小時后，空白組CD133和CD44雙陽性細胞數量為（1.16±1.01）%，對照組細胞CD133和CD44雙陽性細胞數量為（0.99±1.12）%，實驗組CD133和CD44雙陽性細胞數量為（0.36±0.88）%，提示過表達miR425抑制結直腸癌干細胞的自我更新能力。

HCT116細胞轉染48小時后，將20個單細胞種植于基質膠表面，直至形成肉眼可見的克隆時，終止實驗，結果顯示，空白組、對照組和實驗組腫瘤球細胞數目為（4±1）、（5±1）和（2±1）。實驗組形成的腫瘤球數目最少。

2.2 細胞生長

CCK8實驗檢測空白組活性為（0.62±0.23），對照組為（0.72±0.13），實驗組為（0.32±0.05），實驗組生長能力明顯受到抑制。

2.3 蛋白質印跡雜交(Western bloting)和Real-Time PCR檢測miR425和PDL1表達

HCT116細胞轉染48小時后，Real-Time PCR 檢測顯示，實驗組的miR-425的相對表達水平為（201.4±21.3），對照組與空白組分別為（2.1±1.23）和（2.4±0.88），實驗組明顯高于對照組與空白組（P＜0.05）。Western blot實驗結果顯示，空白組、對照組和實驗組PDL1的相對表達量為（0.97±0.12）、（0.93±0.22）和（0.34±0.13），實驗組PDL1表達顯著降低。miR-425的表達與PDL1表達成負相關。

3.討論

在生物體細胞中RNA含量豐富，除了mRNA、tRNA和rRNA外，還存在其他的非編碼小RNA，它們在細胞內扮演了非常重要的角色，構成了細胞內高度復雜的RNA調控網絡。miRNA在生物體的多種調控過程中扮演著重要作用例如細胞增殖、細胞周期、細胞死亡、細胞衰老、細胞分化和器官發育等過程。有學者認為結直腸癌是由一小群未分化、致瘤性CD133細胞產生和擴增的惡性腫瘤，CD133應該可以成為將來臨床治療結直腸癌的有效靶點[4]。如果腫瘤的生長、轉移、和耐藥的根源確實是由于少量腫瘤干細胞，納米這就可以解釋目前臨床上惡性腫瘤治療失敗的原因。因為目前臨床使用的多數治療方法并不是針對腫瘤干細胞的，所有盡管它們可以使惡性腫瘤體積縮小甚至完全消退，但這些效果通常是短暫的[5]。只要腫瘤干細胞沒有被根除，納米剩下的腫瘤干細胞足以導致腫瘤復發和轉移。因此，針對腫瘤干細胞的治療戰略可能是根治腫瘤、阻止腫瘤轉移和解決腫瘤耐藥的關鍵。

本文設立了空白組、對照組和實驗組3組細胞利用PEG納米脂質體包裹的miR-425高效的將miRNA運輸至細胞內，僅有100nmPEG納米脂質體極易穿過毛細血管，延長了腫瘤組織與脂質體的接觸時間，納米脂質體在腫瘤組織部位聚集，濃度得到提升，提高了藥物或miRNA對腫瘤的靶向作用。研究證實PEG納米脂質體能夠延長脂質體在血液循環中存留時間，并且能夠高效的將藥物或其他小分子物質帶到腫瘤組織部位，提高了藥物的時效性。

細胞功能實驗檢測miR-425過表達后細胞增殖、侵襲和遷移能力變化。結果顯示miR-425過表達能夠明顯抑制結直腸癌干細胞的自我更新能力、結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移。雙熒光素酶證實miR-425通過抑制PDL1的表達抑制結直腸癌的生長。因此，本研究系統研究了miR-425抑制腫瘤干細胞干性和分子機制。與本文研究結果一致，賈等[6]研究證實miR-425能夠通過降低PDL1表達抑制結直腸癌生長和增殖能力。綜上所述，探究了miR-425在結直腸癌干細胞中的作用及其發揮生物功能的分子機制，為結直腸癌的治療提供新的靶標。