超高效液相色譜-質譜法測定四君子湯含藥血清中人參皂甘Rg1、Re、Rb1的含量

尚如霞 徐衛東（通訊作者） 謝超

（1鎮江市食品藥品監督檢驗中心 江蘇 鎮江 212000）（2江蘇大學 江蘇 鎮江 212000）

四君子湯為中藥傳統的健脾基礎方，對肝纖維化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的臨床療效。四君子湯組方為人參、甘草、白術、茯苓，其發揮主要功效的為人參。人參皂甘Rg1、Re、Rb1為人參的代表性成分，也是四君子湯含藥血清成分測定的目標。本文建立一種專屬、靈敏、準確、操作簡便的超高效液相色譜-質譜聯用方法，用于四君子湯含藥血清中人參皂甘Rg1、Re、Rb1的同時測定。

1.實驗材料

1.1 藥品、對照品與試劑

人參：亳州市京皖中藥飲片廠，產地：吉林，批號：161001，中國。

白術：安徽井泉中藥股份有限公司，產地：浙江，批號：20170801，中國。

茯苓：安徽惠隆中藥飲片有限公司，產地：安徽，批號：20170701，中國。

炙甘草：安徽和濟堂中藥飲片有限公司，產地：內蒙，批號：20170901，中國。

對照品：人參皂甘Rg1(110704-201726)、人參皂甘Re(110703-201731)、人參皂甘Rb1(110754-201726)，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，體重180～200克，由江蘇大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2009-0002。

1.3 實驗儀器

島津LCMS-8050三重四級桿質譜儀

島津DGU-20A高效液相色譜儀

賽多利斯天平Secura 225D-1CEU

2.實驗方法

2.1 四君子湯水提物的制備

按四君子湯處方,等比例分別稱取人參（9g）、白術（9g）、茯苓（9g）、炙甘草（6g）藥材，加水10倍浸泡3h，煎煮2次（第1次8倍量，第2次6倍量），每次1h，分離藥渣，保留藥液，將所有藥液混勻濃縮至0.4g·ml，合并濾液，4℃冰箱儲存備用。

2.2 藥物血清制備

選擇SD大鼠連續灌胃7天（每天2次），對照組給予蒸餾水，給藥劑量為臨床成人劑量*70*0.018/大鼠體重，在采血前禁食不禁水12h以上，末次給藥后2h麻醉心臟取血，靜置30min，離心（2000轉/分）10min，分離血清。血清用0.2μm微孔濾膜除菌，-70℃冰箱儲存備用。

2.3 含藥血清的處理

隨機取兩只大鼠血清，約4ml，加入20ml甲醇快速混勻震蕩，密閉超聲提取15min，3000轉/分離心10min，取得上清液后于40℃恒溫條件下減壓回收，干燥后殘渣以1ml甲醇溶解，0.45μm濾膜過濾，進樣分析。

2.4 分析條件

色譜條件：shim-pack GIST C18色譜柱（150mm×2.1mm,2μm）；流動相A：水，B：乙腈；流速：0.3mL·min-1；柱溫：20℃；樣品室溫：4℃；進樣量：3μl，梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；噴霧電壓：4KV；負離子檢測；鞘氣（N2）流速：3L/min；輔助氣（N2）流速：10L/min；毛細管溫度：300℃。采用全離子掃描方式，掃描范圍m/z：100～1200，碰撞氣體為氦氣。

3.實驗結果與討論

3.1 分析方法的建立

3種皂苷一級質譜豐度最高的離子峰是[M+Na］+，有少量［M+H］+和［M+K］+，子離子掃描質譜圖見圖1～3，檢測方式為正離子多離子反應監測（MRM），用于定量分析的離子為m/zRg1823.6→643.4；Re969.5→ 789.4；Rb11132.0→ 364.8；定性分析的離子為m/zRg1823.6→203.2；Re969.5→203.15；Rb11132.0→365.2。所用的色譜條件使被分析的化合物在17～30min內被洗脫出來（圖4），人參皂苷Rg1、Re、Rb1的保留時間分別約為17.9、18.0、29.9min，以保留時間和各對離子的響應強度的比例作為定性分析標準，使方法的專屬性更強，有效避免了血漿內源性物質對測定的干擾。

3.2 標準曲線

取空白血清0.5ml,加入人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照溶液，配制成濃度為0.5、5、10、25、50、100、1000ng·ml-1系列標準血清樣品，按2.1血清制備方法處理后，進樣分析，以測得的峰面積Y對血藥濃度X作直線回歸，線性關系良好，標準曲線回歸方程分別為：Rg1Y＝15502X+618，r=0.99998；Re Y＝6037X+1194，r=0.99995；Rb1Y＝65X-605，r=0.9996；定量下限達到0.5ng·ml-1。

圖1 人參皂苷Rg1的子離子掃描質譜圖

圖2 人參皂苷Re的子離子掃描質譜圖

圖3人參皂苷Rb1的子離子掃描質譜圖

3.3 精密度和回收率

取空白血清0.5ml，配制成5、50、1000ng·ml-1濃度的樣品血清，按2.1血清制備方法處理后，每個濃度5份樣品同時測定，計算其標準偏差RSD%為精密度；將樣品血清測得的色譜峰面積與空白血清提取后加入人參皂苷Rg1、Re、Rb1對準品溶液后測得的峰面積相比，考察方法的相對回收率，結果見表2。

表2 精密度和回收率

3.4 穩定性

樣品血清經3次反復凍融和-20℃保存3天仍保持穩定；常溫下放置12h后仍保持穩定，其穩定性可以滿足測定方法的要求。

3.5 樣品血清測定結果

取5只大鼠血清，按照2.2方法進行處理后進樣，測得結果見表3。

表3 樣品血清測定結果

3.6 討論

在臨床上，四君子湯對肝纖維化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的臨床療效。但四君子湯對肝干細胞的作用機制何在，目前尚未闡明。通過對四君子湯含藥血清的研究，檢測出其中人參皂苷的三種即Rg1、Re、Rb1，由于它們在紫外區203nm有末端吸收，且血清中雜質也會有干擾，采用普通HPLC法測定靈敏度和專屬性較差。本文建立的UPLC/MS/MS方法靈敏度高，結果準確，重現性好，操作簡便快速，符合生物樣品分析的要求，測定出了四君子湯含藥血清中人參皂苷Rg1、Re、Rb的含量，進一步闡明了人參為四君子湯發揮作用的主要物質基礎。