HPLC法同時測定心腦健片中表沒食子兒茶素沒食子酸酯和咖啡因的含量

付長華 郞明洋

（花園藥業股份有限公司，浙江金華322121）

0 引言

心腦健片是從純天然綠茶中提取出茶葉提取物，再通過現代化中藥片劑成型工藝制備而成，其主要成分含茶多酚，具有清利頭目、醒神健腦、化濁降脂的功效，亦可用于心血管病伴高纖維蛋白原血癥及動脈粥樣硬化，腫瘤放療、化療所致的白細胞減少癥的治療。

茶多酚（Tea Polyphenols）是茶葉中多酚類物質的總稱，在茶葉中的含量一般在20%～35%。其中，兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的65%～80%，兒茶素類化合物主要包括兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）4種物質，其各組分含量EGCG為50%～60%、EGC為15%～20%、ECG為10%～15%和EC為5%～10%。EGCG是兒茶素類化合物中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%，因為EGCG具有特殊的立體化學結構，所以它具有非常強的抗氧化活性，其抗氧化活性至少是維生素C的100多倍，是維生素E的25倍[1]，能夠保護細胞和DNA，免受損害，對氧自由基的清除（抗氧化）能力強，常用作腫瘤多藥耐藥性的逆轉劑，能夠改善癌細胞對化療的敏感性并減輕對心臟的毒性，在抗癌和心血管疾病治療方面擔當了重要的角色。

茶葉中的咖啡因具有較強的中樞興奮作用，在茶多酚的提取制備過程中作為雜質要盡量去除。以往心腦健片的質量控制主要以紫外分光光度法檢測茶多酚及咖啡因的含量[2]，為了有效控制心腦健片的產品質量，本文建立了同時測定心腦健片中EGCG和咖啡因含量的方法。

1 儀器與試藥

安捷倫Agilent-1100-LC高效液相色譜儀，包括G1311A（四元泵）、G1313A（自動進樣器）、G1316A（柱溫箱）、VWD檢測器、Agilent-1100色譜工作站；分析天平（型號BT125D）。

乙腈為色譜純，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，試驗用水為自制純化水。試驗用EGCG對照品、咖啡因對照品由中國食品藥品檢定研究院提供。心腦健片樣品提供單位：花園藥業股份有限公司，批號：20180301、20180302、20180303；規格：每片含茶葉提取物0.1g。空白輔料均符合藥用標準。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱（5μm，200mm×4.6mm），品牌為FeiniGen；以乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80∶20）為流動相B，按流動相梯度洗脫表（表1）中的規定進行梯度洗脫；流速為1.0mL/min；柱溫為40℃；檢測波長為280nm。理論板數按EGCG峰計算應不低于3000，分離度應大于1.5。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取樣品研細，混勻，取約0.1g，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加25%甲醇適量，超聲處理（功率160W，頻率40kHz）30min，放冷，加25%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備

稱取EGCG對照品約42.5mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含EGCG0.85mg的溶液；稱取咖啡因對照品約7mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，再精密量取2.0mL置于20mL量瓶中，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含咖啡因14μg的溶液。

2.3 檢測波長的選擇

取上述制備的對照品溶液，用島津UV-2450型紫外分光光度計在波長200～400nm處掃描，結果顯示EGCG及咖啡因在280nm波長處有最大吸收值。故以280nm為檢測波長。

2.4 系統適用性試驗

在選定的色譜條件下，經HPLC法測定，EGCG、咖啡因和樣品中其他組分的色譜峰可達到基線分離，且與其他相鄰峰分離度大于1.5，理論板數均在3000以上。

2.5 標準曲線的測定

精密吸取濃度為0.852mg/mL的EGCG對照品溶液2μL、5μL、10μL、15μL、20μL，分別進樣，測定其峰面積積分值，以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為A=916.0777C+10076.8548，r=0.9999。結果表明：表沒食子兒茶素沒食子酸酯在1.704～17.04μg范圍內具有良好的線性關系。

精密吸取濃度為14.2μg/mL的咖啡因對照品溶液1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，分別進樣，測定其峰面積積分值，以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為A=346.2576C+1462.8342，r=0.9998。結果表明：咖啡因在14.2～284.0ng范圍內具有良好的線性關系。

2.6 空白輔料干擾試驗

按心腦健片處方組成，取除茶葉提取物外的輔料，按制備工藝要求制成不含茶葉提取物的陰性對照樣品。然后，按供試品制備的方法制備陰性對照溶液，分別吸取陰性對照溶液與供試品溶液20μL進行檢測。

表1 流動相梯度洗脫表

結果表明：陰性對照品溶液的色譜中，在與EGCG和咖啡因對照品色譜峰相應位置上無峰，說明空白輔料無干擾。

2.7 精密度試驗

精密吸取供試品溶液（20180301），重復進樣5次，每次20μL，分別測定EGCG和咖啡因峰面積，計算得到其RSD分別為0.82%和0.50%。

結果表明：本方法精密度良好。

2.8 重現性試驗

按含量測定方法，對同一批樣品（20180301）分別制備6份供試品溶液，精密吸取各供試品溶液20μL注入液相色譜儀進行檢測，記錄EGCG和咖啡因色譜圖與峰面積，EGCG平均含量為39.5mg/片，其RSD為0.58%；咖啡因平均含量為0.8mg/片，其RSD為0.62%。

結果表明：本方法重現性好。

2.9 溶液穩定性試驗

取“2.2”項下的供試品溶液（20180301）置于室溫下放置，于0h、2h、6h、12h、24h分別進樣20 μL進行檢測，分別記錄EGCG和咖啡因色譜圖與峰面積，計算得到其RSD分別為1.02%和0.86%。

結果表明：樣品在24h內穩定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取心腦健片樣品（20180301）6份，分別精密稱定，再分別加入EGCG和咖啡因對照品，按供試品溶液制備項下的方法測定，記錄色譜圖，考察本方法的加樣回收率。

結果表明：EGCG平均回收率為98.62%，RSD為1.58%；咖啡因平均回收率為98.75%，RSD為0.85%。

2.11 含量測定

各批樣品按“2.2”項下方法制備成供試品溶液、對照品溶液，精密量取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算，3批樣品的EGCG和咖啡因含量測定結果如表2所示。

根據《藥典》規定，心腦健片中EGCG含量應≥36.0mg/片，咖啡因含量應≤2.0mg/片。從表2可以看出，3批心腦健片樣品中的EGCG和咖啡因含量均符合《藥典》規定。

3 結語

（1）流動相及洗脫方法的選擇：參考文獻[3-4]，本試驗分別采用了不同系統的流動相進行試驗：乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75）、甲醇-0.1%磷酸溶液（28∶72）進行等度洗脫；以乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80∶20）為流動相B，按規定進行梯度洗脫50min。

結果表明：以乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）為流動相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80∶20）為流動相B，進行梯度洗脫，樣品峰與干擾峰完全分開，峰形對稱，分離效果最佳。

（2）供試品提取時間的選擇：取樣品內容物加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，分別超聲處理20min、30min、40min，放冷。分別取供試品加入高效液相色譜儀測定，測定結果表明：樣品經超聲提取30min，EGCG和咖啡因的含量不再增加，因此樣品超聲提取時間定為30min。

表2 3批樣品EGCG和咖啡因含量測定結果

（3）采用HPLC法測定心腦健片中EGCG和咖啡因的含量，在一定的色譜條件下具有良好的穩定性，定量結果重復性好，靈敏度高，專屬性強，能較好地控制產品質量。