七葉樹花揮發油的GC-MS方法優化及β-葡萄糖苷酶對七葉樹花的增香作用

高玉瓊，郭利影，孟憲鑫，張麗娜，楊廣德

(西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061)

中華七葉樹 (AesculuschinensisBunge)又名七葉樹、婆羅樹、娑羅樹，屬七葉樹科七葉樹屬植物[1]，是一種良好的觀賞樹種，又具有很高的醫療保健價值。目前，已有報道[2]對七葉樹種子的化學成分、藥理作用等做了描述，認為其主要含有五環三萜皂苷類化合物及黃酮苷類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等方面的作用。近年來其種子中也分離出了6種新的三萜皂苷，且經過毒性試驗認為其對MCF-7細胞具有活性抑制作用[3]。同時，尉芹[4]等對七葉樹葉提取物進行了抗氧化性能研究，同時初步鑒定出其提取物中含有酚類及鞣質、有機酸、黃酮類化合物、植物甾醇等活性成分。劉宏偉[5]等從七葉樹樹葉中分離得到了4個化合物：原七葉樹皂苷元、21-當歸酰基-原七葉樹皂苷元、21β-當歸酰基-原七葉皂苷配基-3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)][β-D-吡喃葡萄糖基(1-4)]β-D-吡喃葡萄糖醛酸和異秦皮苷。劉軍生[6]等還從七葉樹的根和莖中分離出了一株具有高產七葉皂苷C的內生真菌EA-LIS80，而七葉樹花揮發油的化學成分目前尚未報道。為進一步探討其花的化學成分與其種子等的異同，采用了在揮發性成分測定中使用較為廣泛的氣相色譜-質譜聯用法，參考文獻方法[7]對七葉樹花的揮發油進行了氣相色譜-質譜分析。

β-葡萄糖苷酶是一種廣泛存在于生物界的水解酶，它能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。不僅如此，β-葡萄糖苷酶還能將果蔬及茶葉中的風味前體物質水解為具有濃郁天然風味的香氣物質[8-10]。本實驗利用β-葡萄糖苷酶水解七葉樹的鮮花、干花及干燥花苞，以驗證β-葡萄糖苷酶對其是否具有增香作用。

1 實驗材料及方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：新鮮七葉樹花及花苞于2018年5月采自西安交通大學藥學院的藥園，由西安交通大學藥學院牛曉峰教授鑒定為七葉樹科植物七葉樹(AesculuschinensisBunge)的花。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質譜聯用儀(日本島津)；AY120電子天平(日本島津)。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 u/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公，色譜純)；無水硫酸鈉(西安化學試劑廠，分析純)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠，分析純)；檸檬酸(成都化學試劑廠，分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應。分別稱取2份200g新鮮七葉樹花(或干花或干燥花苞)于500mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中一份加0.2g β-葡萄糖苷酶，同時置于搖床中50℃恒溫水浴5h。同法制備空白溶液。

1.2.2 揮發油的提取。200g β-葡萄糖苷酶水解前后的鮮花、干花及干燥花苞，分別進行水蒸氣蒸餾，餾液用正己烷萃取，無水硫酸鈉干燥后回收溶劑得揮發油約0.1g，得率為0.05%。揮發油為淡黃色透明油狀液體。將提取得到的揮發油用正己烷溶解并定容至10mL。

1.2.3 氣相色譜-質譜聯用的色譜條件篩選。實驗采用SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細管色譜柱，載氣為He，其它色譜條件進行比較篩選后確定。

1.2.3.1 升溫程序：于10mL量瓶中取1mL七葉樹花揮發油提取物進樣，在色譜柱始溫為80℃，保持2min后以10℃/min升溫至110℃，再分別以5℃/min升溫至260、270和280℃，保持2min的條件下進樣分析，結果表明升溫至280℃為宜。

最終確定升溫程序為：柱始溫80℃，保持2min，以10℃/min速率升到110℃，再以5℃/min升溫至280℃，保持2min，可達到較好分離。

1.2.3.2 分流比：在確定升溫程序后，分別設定分流比為40∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1和直接進樣，進行分析，結果顯示分流比的改變會影響出峰時間與峰強度，在對比峰形及峰強之后，確定分流比為5∶1。

1.2.3.3 流速：不同的載氣流速會引起成分出峰時間的改變，故分別于流速為0.6、0.8、1.0 mL/min的條件下進樣，結果顯示當流速為0.8 mL/min時其色譜峰分離效果較好。

1.2.3.4 離子源電壓：在6種不同的離子源電壓30、40、50、60、70、80eV下進行分析，在70eV時峰強度最大峰形最好，故確定以70eV為宜。

1.2.3.5 離子源溫度：分別于離子源溫度為230、250℃的條件下進樣分析，結果顯示250℃時峰形較好，峰強較大，故確定以250℃為宜。

1.2.3.6 接口溫度：在2種不同接口溫度250、280℃下進行分析，結果顯示主成分相對含量幾乎無差別，同時參照儀器設置接口溫度需比離子源溫度高20 ～ 30℃，故確定以280℃為宜。

1.2.3.7 進樣口溫度：分別于進樣口溫度為260、280、300℃下進樣分析，主成分相對含量幾乎無差別，考慮到進樣口溫度比樣品分析最高溫度約高20℃，確定以280℃為宜。

通過上述篩選，最終確定氣相色譜-質譜聯用的分析色譜條件，氣相色譜：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細管色譜柱，進樣口溫度280℃，接口溫度280℃，載氣為氦氣，流速0.8 mL/min，分流比5∶1。升溫程序：柱始溫80℃，保持2min，以10℃/min速率升到110℃，再以5℃/min升溫至280℃，保持2min。質譜：離子源電壓70eV，離子源溫度250℃，進樣量1.0μL；質量掃描范圍45～550m/z；溶劑峰切除時間為2.5min，質譜檢測起測時間為3.0min。質譜圖計算機檢索數據庫：NIST譜庫檢索。

2 結果

采用氣相色譜-質譜聯用方法對干燥七葉樹花的揮發油提取物進行分析，其總離子流圖結果如下：

通過分析比較，確定色譜條件篩選后的氣相色譜-質譜聯用分析方法對色譜峰可以達到較好的分離。新鮮七葉樹花及干燥花苞的揮發油提取物也采用同樣方法進行測定。通過計算機譜庫檢索及核對質譜圖，鮮花、干花、花苞及酶水解后的鮮花、干花、花苞揮發油提取物的化學成分分析見表1。

表1 新鮮、干燥七葉樹花及其干燥花苞的化學成分分析

注：*代表加β-葡萄糖苷酶組

本次實驗從新鮮七葉樹花的揮發油提取物中確證了44個化合物，從七葉樹干花的揮發油提取物中確證了27個化合物，從七葉樹花苞的揮發油提取物種確證了34個化合物。

由表1可知，在新鮮七葉樹花揮發油中的含有許多醇類及酸類物質，其主要成分為反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇(10.34 %)、反式氧化芳樟醇(8.94%)、芳樟醇(8.30%)、鄰二甲苯(7.67%)、棕櫚酸(6.79%)、桃金娘烯醇(5.74%)等。在干燥七葉樹花揮發油中主要物質也含有許多醇類及酸類物質，其主要成分為6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(16.10%)、鄰苯二甲酸二丁酯(9.10%)、鄰苯二甲酸酯(8.89%)、壬醛(8.74%)、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化吡喃醇(7.55%)、庚醛(6.18%)等。在七葉樹花苞揮發油中主要成分為醇類、其主要成分有有冰片(29.18%)、桃金娘烯醇(5.96%)、植物醇(4.84%)、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化吡喃醇(4.07%)、鄰苯二甲酸二丁酯(3.72%)、花生酸(3.71%)等。

通過表1的對比，可知在鮮花中β-葡萄糖苷酶存在作用。對比可知在加入β-葡萄糖苷酶后棕櫚酸、正十二烷、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮的相對含量分別增加12.99%、4.86%、1.39%，增長率達到191.43%、260.44%、32.25%。同時植物醇、反式-橙花叔醇、紫蘇醛、和金歡醇、冰片、雪松醇等物質的相對含量也有所增加。同時可以觀察到反式氧化芳樟醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、桃金娘烯醇及反式芳樟醇等物質的相對含量出現明顯降低。

干花通過表1比較可知，在干花中加入β-葡萄糖苷酶反應，6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、異丁香酚、香葉醇、(R)-(+)-β-香茅醇、反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、茉莉酮、苯乙醛的相對含量有所增加，6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、異丁香酚、香葉醇及(R)-(+)-β-香茅醇的增加量較多分別為5.50%、0.59%、0.36%、0.27%，增長率分別達到了34.14%、62.46%、16.47%、25.27%，干花中其余物質含量均下降。

通過對比表1花苞結果，可知在花苞中加入β-葡萄糖苷酶后部分化合物的含量有所增加，其中棕櫚酸相對含量顯著增加5.24%，增加率達到174.07%，同時2-異丙基-5-甲基-1-庚醇相對含量增加3.26%，增加率達到592.59%。還可以觀察到甲基庚烯、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化吡喃醇、桃金娘烯醇、香葉醇、紫蘇醇、丁香酚、茉莉酮等成分均有所增加，但是其余成分的相對含量均有所減少，其中冰片相對含量出現明顯減少，達到3.92%。

3 結論

通過建立并優化七葉樹花揮發油的氣相色譜-質譜聯用分析方法，測定了其鮮花、干花及干燥花苞揮發油的化學成分主要以醇類化合物為主，為進一步開發和利用七葉樹資源提供了理論依據。同時通過對七葉樹花揮發油的成分分析，可知其含有很多香精類成分，例如桃金娘烯醇、香葉醇、紫蘇醇、丁香酚等，而β-葡萄糖苷酶則可以促進鮮花及花苞中這些香精類成分的釋放，且其對花苞的作用強度大于鮮花，這證明了β-葡萄糖苷酶可水解鮮花及花苞的香氣前體物質，釋放出鮮花中潛在的香氣成分，但由于β-葡萄糖苷酶的加入，致使某些香精類成分含量有所減少，推測其只能增加七葉樹花中的某些特定成分，而不能使全部香精成分的相對含量增加，故其對七葉樹花的增香作用并不明顯。