血必凈注射液中有效成分的HPLC法定量檢測△

李娣，曹雪曉，蒲位凌，孫立麗，任曉亮

(天津中醫藥大學 中藥學院，天津 300193)

血必凈注射液是我國著名的急救醫學專家王今達教授，根據中西醫結合“菌、毒、炎并治”的新理論和臨床經驗[1]，以血府逐瘀湯組方為基礎研發而成的中藥復方注射液。其屬于國家中藥保護品種，由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸5味中藥制成，適用于感染誘發的全身炎性反應綜合征，即膿毒癥[2]。血必凈注射液成分復雜，其抗炎機制具有多靶點作用[3-4]，其中丹參素可明顯抑制鈣離子載體[5]；洋川芎內酯Ⅰ可保護因過氧化氫誘導的PC12細胞損傷[6]；芍藥苷能調節一氧化氮水平及抑制細胞內鈣超載[7-8]；阿魏酸可抑制小膠質細胞活化和保護脂多糖誘導PC12細胞損傷[9-10]；羥基紅花黃色素A可抑制炎癥介質釋放和降低炎性因子表達[11-12]，從而表現抗炎作用。此五種成分結構各不相同，如圖1所示。

圖1 五種成分的化學結構式

目前，血必凈注射液的檢測方法主要是HPLC[13-15]。本實驗為了更方便有效地控制血必凈注射液的質量，根據其藥理作用和各活性成分發揮藥理作用的機制，分別從紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸等五味中藥中選擇具有抗菌消炎活性的羥基紅花黃色素A、芍藥苷、洋川芎內酯Ⅰ、丹參素和阿魏酸為活性指標成分[16-20]，建立了一種簡便、快速、準確的同時測定血必凈注射液多種活性指標成分的質量控制方法，力圖為血必凈注射液全面質量控制標準的建立提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑

血必凈注射液(天津紅日藥業股份有效公司，規格：每支10 mL，三批批號分別為：1205301、1208171、1311081)；芍藥苷對照品(天津中新藥業研究中心，純度≥98%)，丹參素對照品(天津中新藥業研究中心，純度≥98%)，洋川芎內酯Ⅰ對照品(南京拓海生物科技有限公司，純度≥98%)，羥基紅花黃色素A對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量以92.5%計，批號：11637-201106)，阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量以99.6%計，批號：110773-201012)。甲醇(天津市大茂化學試劑廠，分析純)，甲醇(美國sigma公司，色譜純)，甲酸(美國Meridian Medical Technologies公司，色譜純)。

1.2 儀器

Waters e2695 system高效液相色譜儀，DAD 檢測器(美國Waters公司)，BT1250D分析天平(德國Sartorius公司)，XW-80A 微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm，5m)；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：1=280 nm(丹參素、洋川芎內酯Ⅰ)，2=390 nm(羥基紅花黃色素A)，3=323 nm(阿魏酸)，4=230 nm(芍藥苷)；進樣量：10L；流動相：甲醇(A)-0.3%甲酸水(B)，梯度洗脫。梯度洗脫條件：0～6 min，8%～12%A；6～11 min，12%～18%A；11～26 min，18%～30%A；26～30 min，30%～45%A；30～31 min，45%～8%A；31～40 min，8%A。該色譜條件下，五種指標成分的色譜圖如圖2所示，各化合物均得到良好分離。

注：1.丹參素；2.羥基紅花黃色素A；3.芍藥苷；4.阿魏酸；5.洋川芎內酯Ⅰ。圖2 280 nm下混合對照品(A)和血必凈注射液(B)的HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品儲備液 分別精密稱取丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和洋川芎內酯Ⅰ對照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，以50%甲醇定容，得到濃度分別為1034、2190、1082、1024、960 μg·mL-1的對照品儲備液，精密量取各對照品溶液適量制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取2 mL血必凈注射液完全轉移至10 mL 棕色容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，以同樣方法平行制備三份，作供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系 分別吸取混合對照品溶液適量，用近中性水逐級稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液，搖勻，HPLC測定。以對照品質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得各成分的線性回歸方程見表1。

表1 血必凈注射液五種對照品的線性回歸方程

2.3.2 精密度試驗 配制各成分與測定樣品響應相近的混標溶液，按2.1項下色譜條件進樣6針測定峰面積，計算精密度。丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ五種成分的RSD分別為1.05%、0.43%、0.09%、0.09%、0.96%，5種成分的RSD值均小于1.05%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，依照2.1項下色譜條件進樣測定峰面積，計算RSD值。丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ五種成分的RSD分別為2.84%、0.83%、0.49%、1.11%、1.25%，各成分RSD值均小于2.84%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的血必凈注射液樣品1 mL，置于高溫滅菌10 mL的棕色容量瓶中，再分別精密加入適量對照品儲備液溶液，甲醇定容，搖勻，制成供試液。平行6份，按2.1項下的色譜條件將上述6份樣品溶液分別進樣10 μL，進行測定。計算丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ五種成分的平均回收率和RSD值(n=6)，結果見表2。計算得到血必凈注射液中5種成分的平均回收率為98.85%～103.22%，RSD小于1.27%，表明該方法加樣回收率符合要求。

表2 血必凈注射加樣回收率試驗結果(n=6)

2.4 指標成分含量測定

按照2.2.2項下方法制備分別配制供試品溶液3份(三個批次)，按2.1項下的色譜條件分別進樣10 μL，根據2.3.1中的線性范圍計算可得，分別取三批次的平均值，得到血必凈注射液中丹參素、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ的平均含量分別為14.2±0.2、464.5±1.4、1 489.2±4.0、27.8±0.2、 60.6±0.5 μg·mL-1。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

血必凈注射液是由紅花、當歸、赤芍、川芎、丹參五種藥材提取加工制成的注射液，由于中藥本身的復雜性，筆者根據以下兩個因素選擇了五種成分作為定量測定的指標成分。首先，綜合血必凈注射液相關藥理作用以及其中各活性成分藥理作用的作用機制，從其中選擇五種相關性較大的成分作為定量評價指標，保證指標成分發揮的藥理作用能夠部分代表血必凈制劑的藥理作用。其次，根據《中華人民共和國藥典》(2015版)及相關文獻，從每種藥材中選擇一種具有明顯藥理活性的成分作為指標成分，即分別從紅花、當歸、赤芍、川芎、丹參中選擇了羥基紅花黃色素A、阿魏酸、芍藥苷、洋川芎內酯和丹參素，且這五種指標成分化學結構類型多樣，有黃酮、有機酸、萜類及內酯，這使得實驗結果更具有普遍性和適用性。

3.2 色譜條件的選擇

血必凈注射液的成分復雜，為提高分析靈敏度，減少測定干擾，實驗采用梯度洗脫。發現甲醇的洗脫效果優于乙腈。流動相考察了甲醇-0.2%的磷酸水、甲醇-0.2%的甲酸水以及甲醇-0.3%的甲酸水，結果發現甲醇-0.3%的甲酸水得到的色譜峰峰形和分離度較好。在檢測波長的選擇上，雖然在280 nm檢測波長下的色譜峰最多，反映的成分信息更全面，但因五種成分結構各異，在同一波長下檢測靈敏度較低，因此，本實驗選用DAD檢測器，根據五種成分的最大吸收波長，提取不同波長下的色譜圖分別定量測定五種成分，用以提高分析準確度。

4 結論

在中藥類市場國際化的大趨勢之下，我國中藥材的出口貿易快速增長，但隨之而來的質量安全問題卻阻礙了我國中藥材產品進入國際市場，使我國的中藥材安全性遭受到了質疑[21]。現行的中藥質量標準主要依照化學藥品的質量標準模式建立，即選定某一中藥的“有效成分”，建立相應的定量標準，然而，對于成分復雜的復方制劑而言，只建立某單一成分的含量測定在很大程度上存在著片面性。因此，本實驗基于血必凈注射液的藥味組成、化學成分和藥理作用，選擇具有抗菌消炎活性的丹參素、羥基紅花黃色素、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ為活性指標成分，使用HPLC-DAD法在不同波長下同時測定5種成分。此方法簡便、快速、準確，可為血必凈注射液全面質量控制標準的建立提供參考。