苦蘵育種F1群體真偽鑒定△

劉玉洋，何金宇，劉朋麗，馮尚國，王慧中，盧江杰

(杭州師范大學 生命與環境科學學院/浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310018)

苦蘵PhysalisangulataL.為茄科酸漿屬草本植物，又稱為苦蘵草、天泡草、炮仔草等，在秦漢時期的《爾雅》中已有記載，其果、根和或全草皆可入藥，是傳統中藥材。苦蘵長有短毛或無毛，莖多分枝，葉片呈橢圓形，果實為球形，包于宿萼中，種子為圓盤狀，花、果期為5～12個月[1]。現代醫學研究表明，苦蘵中含有多種化學成分，主要有甾體類、甾醇類、有機酸、多糖等[2-4]，可用于治療天皰瘡、疔瘡、痢疾、感冒、咳嗽等疾病[5]，有抗腫瘤、免疫調節、抗炎、抗菌等藥理活性[6-9]，具有很高的藥用價值和經濟價值。苦蘵有效成分含量因地域不同而有一定差異，因此，培育高活性成分的苦蘵新品種，尤其是挖掘現有野生苦蘵種質資源中有效成分含量遺傳基礎成為育種工作者以及科研人員的重要課題。

高密度遺傳圖譜是QTL定位研究的重要依據，可為分子標記輔助選擇育種提供工具，而分離群體的構建是繪制高密度遺傳連鎖圖譜的關鍵因素，分離群體質量的好壞也直接決定了遺傳圖譜構建的難易程度。若分離群體中真雜交種數所占的比例越高，則表明該群體質量越高。因此，快速、準確鑒定出真雜種是評估分離群體質量的重要方法。鑒定分離群體真雜交種的方法主要有形態觀察法、同工酶鑒定法、細胞學鑒定法和分子標記鑒定法等[10]，與其他三種鑒定方法相比，分子標記鑒定法更加準確，可以有效的減少人為因素的影響，并且操作簡單、方便快捷。SSR分子標記具有共顯性強、多態性豐富、穩定性高、分布廣泛、數量多、重復性好、模板DNA質量要求不高等特點[11-15]，已被廣泛應用于農作物雜交后代真偽的快速鑒定。張敏等[16]利用SSR對鄂茄子2號雜種一代群體進行純度鑒定，在140份樣品中有4份為雜合子，剩余136株均為純合子，占總數的97%。陸鑫等[17]構建了甘蔗熱帶種“路打士”與滇蔗茅“云南95-19”的雜交F1代群體，利用4對SSR引物進行62份雜交后代的鑒定，發現雜交真實率高達100%。張寧潔[18]從120對SSR引物中篩選出2對引物用于甘藍型油菜雜交種純度的分子標記鑒定，發現油菜雜交群體F1代的純度在90%以上。

目前對藥用植物苦蘵的研究大多集中在有效成分[19]、遺傳多樣性[20]方面，雜交群體的構建和雜交后代真偽鑒定等研究未見報道。本研究利用SSR分子標記技術對苦蘵雜交群體進行雜種鑒定，為苦蘵高密度遺傳圖譜的構建和有效成分的QTL定位等相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗材料由浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室提供，利用苦蘵臨海種源(♀)和浦江種源(♂)構建苦蘵雜交群體F1代，對85個雜交F1后代進行雜交種真偽的分子鑒定。選取新鮮苦蘵葉片，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蘵基因組DNA的提取 使用本實驗室改良的CTAB法提取苦蘵基因組DNA[21]，與其他方法相比，該方法做了以下改良：將苦蘵葉片充分研磨后，取適量粉末于離心管中，迅速加入適量CTAB-free溶液，離心后除去上清液，本步操作可有效除去葉片中多糖等雜質，確保提取的苦蘵基因組DNA純度高。

利用紫外分光光度計檢測苦蘵基因組DNA濃度以及OD260/280比值，利用瓊脂糖凝膠電泳技術檢驗有無蛋白質、RNA等雜質的污染以及是否降解。待檢測合格后，將苦蘵基因組DNA母液稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存，用于后續PCR擴增實驗。

1.2.2 苦蘵SSR引物的初步篩選 本實驗所用引物是基于苦蘵轉錄組測序所得序列設計的SSR引物，由上海生工生物公司合成，共計200對SSR引物。以臨海、浦江雙親本和兩個雜交后代單株18號和45號的DNA為模板，從200對引物中初步篩選出條帶清晰、重復性好、多態性豐富的真實SSR引物，用于后續實驗。

1.2.3 PCR擴增反應 PCR反應體系(20 μL)：10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.6 μL，Primer F(10 μmol·L-1)1 μL，Primer R(10 μmol·L-1)1 μL，Taq酶(2U·L-1)1 μL，苦蘵基因組DNA(50 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 13.4 μL。

PCR反應程序如下：94 ℃預變性3 min，30個循環(94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸90 s)，72 ℃延伸10 min后，4 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 ①凝膠制備：用量筒分別量取6%丙烯酰胺80 mL，10%過硫酸銨800 μL，TEMED 50 μL，在燒杯中充分搖勻后，緩慢倒入兩玻璃板間，確認無氣泡后，插上梳子，水平放置半小時至膠凝固。②電泳：向擴增產物中加入2 μL loading buffer，低速離心均勻后，取3 μL混合液點樣。連接電源，200 V恒壓電泳1小時。③銀染：電泳結束后，從玻璃板中取出凝膠，用蒸餾水漂洗三次，除去凝膠上的緩沖液。用0.1%的AgNO3溶液銀染10 min，在蒸餾水中漂洗三次，除去凝膠上殘留的AgNO3溶液。將凝膠置于顯影液中直至顯示出明顯條帶后，蒸餾水漂洗三次，除去顯影液。取出凝膠置于顯影板上拍照，用保鮮膜包好，4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 苦蘵SSR引物的初步篩選

我們選擇臨海、浦江雙親本和兩個雜交后代單株18號和45號的DNA為模板，用于苦蘵SSR引物的初步篩選。經過聚合酶鏈式反應擴增目的片段，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染，拍照，得到苦蘵SSR引物初步篩選的電泳圖，圖1為部分電泳圖。

在苦蘵SSR引物初步篩選電泳圖中，我們挑選出有清晰條帶且在苦蘵雙親間有明顯差異的引物(紅框標注)用于后續苦蘵雜交群體的真雜交種鑒定研究，最后我們從200對苦蘵SSR引物中初步篩選出56對用于后續分析。

注：圖中M為DNA標準分子量；數字編碼為所用SSR引物編號；每個方框中為雙親和兩個雜交后代。圖1 苦蘵SSR引物初步篩選的電泳圖

2.2 苦蘵雜交群體的鑒定

我們將初步篩選出的56對SSR引物用于苦蘵雜交群體的真偽鑒定研究，經聚合酶鏈式反應擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測、銀染、拍照后，得到兩對SSR引物可用于苦蘵雜交群體F1代真雜交種的鑒定。兩對苦蘵SSR引物詳細信息如表1所示。

表1 篩選出的2對SSR引物信息

根據苦蘵PCR產物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，我們將F1代單株的帶型分為三種，分別是雙親互補型、母本型和缺失型[22]，如圖2所示。雙親互補型是指子代中至少含有一條母本和父本的特征帶；母本型是指子代的帶型與母本帶型相同；缺失型是指子代帶型與雙親帶型均不相同，缺少一條或一條以上特征帶。在真雜交種鑒定過程中，雙親互補型的單株為真雜交種，母本型和缺失型的單株需要用其他SSR引物進一步鑒定。

圖2 苦蘵SSR引物電泳帶型圖

如圖3所示，利用引物SSR0959對85個苦蘵雜交群體F1代進行鑒定，在160～200 bp之間，母本臨海種源共有2條帶且皆為特異性條帶，父本浦江種源共有3條帶且皆為特異性條帶，其中雙親互補型的單株有15個，母本型的單株有70個。因此，SSR0959號引物可以從85個F1代群體中鑒定出15個真雜交種，真雜交種數占苦蘵雜交群體總數的18%。

如圖4所示，利用引物SSR0116對85個苦蘵雜交群體F1代進行鑒定，在150～250 bp之間，母本臨海種源共有7條帶，其中特異性條帶有4條，父本浦江種源共有6條帶，其中特異性條帶有4條，在雜交群體F1代中，除編號30的單株為缺失型以外，其余單株均為雙親互補型。因此，利用SSR0116號引物可以從85個F1代群體中鑒定出84個真雜交種，真雜交種數占苦蘵雜交群體總數的99%。

注：M為DNA標準分子量；1～85為雜交后代單株編號。圖3 引物SSR0959對雜交F1群體后代的擴增電泳圖

注：M為DNA標準分子量；1～85為雜交后代單株編號。圖4 引物SSR0116對雜交F1群體后代的擴增電泳圖

利用一對SSR引物鑒定雜交群體的真雜交種，有一定的局限性，無法準確的從雜交群體種鑒定出所有的真雜交種，為確保將雜交群體中所有的真雜交種都鑒定出來，需要用多對引物同時進行鑒定。本研究利用了兩對SSR引物對苦蘵的雜交群體F1代進行鑒定，用引物SSR0116鑒定時，只有30號單株的帶型為缺失型，而當用引物SSR0959鑒定時，30號單株的帶型為雙親互補型即真雜交種。綜上所述，利用引物SSR0116和SSR0959可以鑒定出85個真雜交種，真雜交種數占苦蘵雜交總數的100%，因此，本實驗中苦蘵雜交群體F1代單株均為真雜交種。

3 討論

本研究利用SSR分子標記技術對苦蘵雜交群體F1代的真雜交種進行鑒定，為評估苦蘵雜交F1代群體的質量提供依據，為苦蘵高密度遺傳連鎖圖譜的構建以及與重要數量性狀相關的QTL定位研究奠定基礎。從200對SSR引物中篩選出2對特異性好、穩定性高的引物用于苦蘵真雜交種的鑒定，并且從苦蘵雜交群體F1代中鑒定出85個真雜交種，占雜交群體總數的100%。本研究結果表明，SSR分子標記技術可以用于苦蘵雜交群體真雜交種的快速、準確鑒定。