川芎中1-(3′，4′-二羥基肉桂酰基)環戊烷-2，3-二醇分離鑒定及含量測定△

羅鐳，邵喜英

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052；2.浙江省腫瘤醫院，浙江 杭州 310022)

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，為臨床常用中藥，具有活血行氣、祛風止痛之功效，主治胸痹心痛、胸肋刺痛、跌撲腫痛、月經不調、經閉痛經、癮瘕腹痛、頭痛、風濕痹痛[1]。現代藥理研究表明，川芎具改善血管內皮功能及冠狀動脈血流量、降低血流阻力及血壓、抗氧自由基、抗炎、抗癌、抗血小板聚集、抗血栓形成、保護視神經等多種藥理活性[2]。目前，研究人員對川芎中揮發油類脂溶性成分研究較多，從中分離得到藁本內酯、洋川芎內酯、川芎三萜等許多脂溶性成分[3-5]，鮮有對川芎中水溶性化學成分研究的報道。然而近年來研究發現，川芎水提液具有治療和保護腦缺血、冠心病、心絞痛等心腦血管疾病的功能。李喆等[6]發現川芎水提液具有抗氧化作用，能降低一氧化碳、丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶的活性。張晶晶等[7]研究表明，川芎水提液在體外具有較明顯的抗氧化活性，其抗氧化效果與濃度呈顯著的線性相關。

基于川芎水提液具有顯著的抗氧化活性，筆者嘗試分離鑒定川芎水提液中抗氧化活性的單體成分。筆者采用反相硅膠、凝膠等柱色譜分離方法，從川芎水提液中分得一水溶性成分1-(3′，4′-二羥基肉桂酰基)環戊烷-2，3-二醇[1-(3′，4′-dihydroxycinnamoyl)cyclopentane-2，3-diol，DC]。DC化學結構新穎，不同于以往報道的洋川芎內酯、藁本內酯等骨架類型，系首次從該植物中分離得到。Wang等[8]從酸櫻桃中分離得到該化合物，并經生物活性檢測表明該化合物具有很強的抗氧化活性，其抗氧化活性與合成抗氧化劑BHA、BHT的抗氧化活性相當。基于該化合物顯著的抗氧化生物活性，本文報道了川芎中DC的含量測定方法，實驗表明該方法簡便、準確、重復性好，可為川芎藥材的質量控制及新藥研發提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DPX 500型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)，LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津公司)，XPE205型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，Elmasonic P超聲波清洗器(德國Elma公司)。

1.2 試藥

收集了5批川芎藥材，購自成都市荷花池中藥材市場，經浙江省食品藥品檢驗研究院中藥所郭增喜主任中藥師鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，標本保存于浙江省食品藥品檢驗研究院中藥所。

反相硅膠ODS填料(日本YMC公司)；Sephadex LH-20凝膠(瑞典Parmacia公司)。DC對照品為實驗室自制，經1H-NMR、13C-NMR確證結構，經HPLC歸一化法測定其純度>98%，滿足定量要求。三氟乙酸、甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 DC的提取、分離和結構鑒定

2.1.1 提取與分離 川芎藥材10 kg，用70%乙醇水回流提取(3×2 h)，減壓回收溶劑至無醇味，加適量水分散，攪拌，靜止，除去沉淀。所得水溶性部位經大孔吸附樹脂柱色譜分離，以水-乙醇梯度洗脫，共得到4個部分，分別為Fr.1(水)、Fr.2(30%乙醇)、Fr.3(70%乙醇)和Fr.4(95%乙醇)。Fr.2(95 g)經ODS反相柱色譜，用甲醇-水進行梯度洗脫，共得到50個部分(Fr.2-1 ～Fr.2-50)，其中Fr.2-9 ～Fr.2-14合并，再經Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化，得到單體化合物DC(250 mg)。

2.1.2 結構鑒定 淺黃色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z281.1[M+H]+；279.1[M-H]-，得出化合物分子量為280.1，結合1H和13C-NMR數據信息，確定化合物分子式為C14H16O6。

1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.04(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.77(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.93(1H，dd，J=8.0 Hz，1.8 Hz，H-6′)，7.55(1H，d，J=16.0 Hz，H-7′)，6.25(1H，d，J=16.0 Hz，H-8′)，5.34(1H，m，H-1)，3.73(1H，m，H-2)，4.18(1H，m，H-3)，2.15(2H，m，H-4)，1.95(2H，m，H-5)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：128.1(C-1′)，115.3(C-2′)，149.8(C-3′)，147.4(C-4′)，116.8(C-5′)，123.3(C-6′)，147.1(C-7′)，115.6(C-8′)，169.1(C-9′)，72.3(C-1)，74.0(C-2)，71.9(C-3)，38.5(C-4)，39.4(C-5)。以上數據與文獻報道一致[9]，故鑒定為1-(3′，4′-二羥基肉桂酰基)環戊烷-2，3-二醇。結構式見圖1。

圖1 1-(3′，4′-二羥基肉桂酰基)環戊烷-2，3-二醇的化學結構

2.2 DC含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.05%三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 ～20 min，5%→20%A)，流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為325 nm，柱溫為30 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取經減壓干燥后的DC對照品5.84 mg，置50 mL量瓶中，用70%甲醇水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.116 8 mg·mL-1對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液3 mL，置于15 mL量瓶中，加70%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，即得0.023 36 mg·mL-1對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理45 min(功率250 W，頻率35 kHz)，放冷，再稱定質量，加70%甲醇水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 系統適用性及專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑各10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖2。在該色譜條件下，供試品溶液色譜圖中具有與對照品溶液色譜圖中DC對照品相同保留時間的色譜峰，空白溶劑在此峰位無吸收，證明陰性無干擾。樣品中待測目標物與其他成分均可達到基線分離，分離度均大于1.5，分離效果好。

注：A.對照品；B.供試品；C.空白溶劑；1.1-(3′，4′-二羥基肉桂酰基)環戊烷-2，3-二醇。圖2 川芎供試品和對照品液相色譜圖

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取2.2.2項下0.023 36 mg·mL-1對照品溶液1、3、5、10 μL及0.116 8 mg·mL-1對照品貯備液3、5、10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=1 481.35X-3 172.54(r=1.000 0)，結果表明DC進樣量在0.023 36 ～1.168 0 μg范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.2.6 儀器精密度試驗 精密吸取0.023 36 mg·mL-1DC對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定色譜峰面積，結果RSD為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批(批號：160606)川芎藥材粉末，按2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，依法測定含量，結果川芎中DC的平均含量為1.082 mg·g-1，RSD為 1.61%，表明方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗 取2.2.7項下同一供試品溶液，分別在0、2、6、10、14、20 h進樣，計算DC峰面積的RSD為0.51%，表明供試品溶液在20 h內穩定性良好。

2.2.9 加樣回收試驗 稱取已知含量的川芎藥材粉末(批號：160606)6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入DC對照品貯備液2 mL，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定含量，計算回收率，結果見表1。

表1 川芎中DC加樣回收試驗結果(n=6)

2.2.10 樣品測定 取不同批號的川芎樣品0.5 g，每批樣品平行3份，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，并用外標法計算樣品中DC的含量，結果見表2。

表2 川芎樣品中DC含量測定結果(n=3)

3 討論

本實驗通過色譜、波譜方法，從川芎水提液中分離鑒定水溶性化學成分DC，該成分系首次從川芎中分離得到。文獻報道DC具有很強的抗氧化活性，與合成抗氧化劑BHT、TBHQ活性相當，但合成抗氧化劑存在安全性問題，使其應用受到很大限制，故從傳統中藥川芎中分得高效無毒的天然抗氧化活性物質DC具有十分重要的意義。

本文比較過超聲提取和熱回流提取對DC含量測定的影響，結果顯示無統計學差異，因超聲提取操作方便，故最終選擇超聲提取。考察過甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇作為提取溶劑，超聲時間分別為30、45、60 min時的提取效率，實驗結果表明最佳提取工藝為70%甲醇超聲45 min。本文建立的含量測定方法簡便、準確、重復性好，含量測定結果表明川芎中均含有較高含量的DC，可為川芎藥材質量標準的制定及資源的開發利用提供參考。