超高效液相串聯質譜法測定豆粕中有機磷類藥物殘留量的研究

徐麗佳，張秀芹，劉 笑，苗 翠，郭國賢，律 瑤

（遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

有機磷是用于防治植物病蟲害的使用最廣泛的一類廣譜、高效農藥，多為磷酸酯類或硫代硫酸酯類。殘留在獸藥和飼料中的有機磷類農藥被動物吸收富集后進入人類食物鏈，易被人體胃腸道吸收，已有醫學報道證明這類化合物會引起人類基因突變等疾病，將嚴重影響人類健康。豆粕是棉籽粕、花生粕等12種動植物油粕飼料產品中產量最大，用途最廣的一種，其作為畜牧業投入品應用于畜禽產品中的濃度高，所以豆粕中的農藥殘留，會對人體健康造成嚴重影響。農業部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農和辛硫磷7種有機磷類農藥在動物肌肉中的最高殘留限量（MRL）為20～4000微克/公斤。目前，我國對豆粕中有機磷類農藥殘留限量并沒有明確規定。現有的有機磷殘留分析多采用氣相色譜法及氣相色譜—質譜法，方法的抗干擾能力較弱，前處理方法多采用凝膠滲透色譜法凈化，處理過程繁瑣，耗費溶劑。而關于豆粕中有機磷類農藥殘留的液相色譜-串聯質譜檢測，現有的方法、文獻及標準均暫未查到。本文采用固相萃取凈化方法，建立了同時測定豆粕中敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農和辛硫磷7種有機磷農藥殘留的方法。該方法具有溶劑用量少、操作簡便、靈敏度高、定性準確等優點。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

美國Waters公司ACQUITY UPLC-TQ Detector超高效液相串聯質譜；Metler NE260分析天平；Therom Biofuge 離心機；JT baker ASEMD 60固相萃取裝置；美國Organomation公司N-EVAP112氮氣吹干儀；Stuart SA 8渦旋混合器；BUCHI Multivapor P-12旋轉蒸發儀。Carb/ PSA (500mg/6cc)小柱，waters公司。

1.2 藥品與試劑

對照品：敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農、辛硫磷均購自上海市農藥研究有限公司（100微克/毫升）。甲醇、甲酸、乙酸乙酯均為色譜純，丙酮為分析純，實驗用水為一級水。

2 方法

2.1 混合對照品溶液配置

精密量取敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農、辛硫磷對照品1.5毫升，置于10毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為15微克/毫升的標準儲備溶液，在-20℃下保存，在3個月內使用。分析時再配制成質量濃度為15、25、50、100、150、200納克/毫升的系列混合標準工作液。

2.2 樣品前處理方法

稱取均質后的豆粕5克(精確到0.01克)于50毫升離心管內，加入10.0毫升乙酸乙酯，渦旋混勻，中速振蕩提取5分鐘，8000轉/分鐘離心5分鐘，傾出上清液，重復提取1次，合并上清液；40℃旋轉蒸發至干，向旋蒸管中加入5毫升丙酮，渦旋混合3分鐘，作為備用液。

將Carb/PSA復合萃取柱用3毫升丙酮活化，取全部備用液過柱，控制流速為1毫升/分鐘，收集流出液，用5毫升丙酮以相同流速洗脫柱子并收集，洗脫液于40℃氮氣吹干，殘余物中加入甲醇：0.2%甲酸水（50∶50）溶液1.0毫升，充分渦旋混勻后，過0.2微米微孔濾膜，液相色譜—質譜/質譜測定。

2.3 UPLC條件

色譜柱：B E H C18（100毫米×2.1毫米，1.7 米）；流動相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5.0分鐘，50%A線性變化至90%A；5.0～5.1分鐘，90%A線性變化至50%A；5.1～7.0分鐘，維持50%A）；流速：0.3毫升/分鐘；柱溫：30℃；進樣量：10微升。

2.4 串聯質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；電離電壓：3.5千伏；源溫：120℃；霧化溫度：350℃；錐孔氣流速：50升/小時；霧化器流速：650升/小時。7種有機磷類藥物的定量定性離子、錐孔電壓和碰撞能量參數見表1。

3 結果與討論

3.1 方法線性

分別精密量取適量的7種有機磷類藥物混合標液，制得濃度為15、25、50、100、150、200納克/毫升系列對照溶液，從中各取1.0毫升，分別溶解空白組織經提取、凈化及濃縮后的殘余物，搖勻，過0.2微米濾膜后作為基質匹配系列混合標準溶液，上機測定。按低濃度到高濃度的順序依次進樣，以對照溶液濃度為橫坐標（X），定量離子對色譜峰面積為縱坐標（Y），求得回歸方程，結果列于表2。可以看出，7種有機磷類藥物在該濃度范圍內線性關系良好，相關系數r均大于0.990。

3.2 方法靈敏度

采用標準添加法，在勻漿后未處理的空白樣品中添加7種有機磷類藥物，按“2.2”項下方法處理和檢測，依據色譜峰信噪比S/N＞3為方法檢測限，S/N＞10為方法定量限，得出7種有機磷類藥物的檢測限為3微克/公斤，定量限為5微克/公斤。空白豆粕樣品中添加14微克/公斤7種有機磷類藥物的色譜圖示于圖1。

圖1 空白豆粕樣品中添加14微克/公斤7種有機磷類藥物的色譜圖

3.3 方法的回收率與樣品檢測結果

采用標準添加法，在勻漿后的未處理的空白樣品中添加7.0、14.0、24.0微克/公斤3個不同濃度7種有機磷類藥物，按“2.2”處理和檢測，進行回收率試驗，每批次進行6個樣品的平行試驗，得出7種有機磷類藥物在3種添加濃度的回收率范圍為67.6%～97.8%，批內RSD范圍為0.5%～9.7%，批間RSD范圍為3.4%～16.5%，均小于20%，詳細結果見表3。同時，對來自遼寧省內不同廠家的30個飼料豆粕實際樣品，按“2.2”處理和檢測，測得的實測樣品中7種有機磷類藥物均為未檢出。

表2 7種有機磷類藥物校正曲線

表3 7種有機磷類藥物在不同濃度加標回收率，相對標準偏差（RSD）

3.4 色譜條件的建立

考察了甲醇-0.2%甲酸水、乙腈-10毫摩乙酸銨溶液兩種流動相對分析效果的影響。結果表明，采用甲醇-0.2%甲酸水為流動相時，有機磷農藥的離子化效果較好，靈敏度高，采用梯度洗脫的方式，7種有機磷藥物分離度較好。

3.5 質譜檢測方法的建立

常用的質譜電離源有ESI源、APCI源和APPI等，摸索質譜條件時，以不同的錐孔電壓進行正負離子掃描，發現7種有機磷農藥均在正離子模式下響應較好。采用較高濃度的標準溶液，在正離子模式下進行母離子全掃描，確定各種藥物的準分子離子，然后以準分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，獲得二級質譜響應較強的子離子，最后以多反應監測模式進行采集。

3.6 樣品前處理

有機磷農藥是親酯性化合物，不溶于水，易溶于有機溶劑。植物性產品主要用于二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等極性較大的溶劑進行提取。本文比較了乙腈、乙酸乙酯和乙酸乙酯：正己烷（9∶1）三種溶劑的提取效果，見圖2。結果表明，用乙酸乙酯的提取效果最好，提取液干凈、雜質少。固相萃取方法具有省時、省溶劑、操作安全、重復性好的特點，常用的有機磷藥物的固相萃取柱主要有活性炭萃取柱、C18反相固相萃取柱和Carb/NH2（碳黑/氨基）復合萃取柱。本文選取Carb/PSA復合萃取柱，凈化效果好，回收率較高，能有效去除樣品中的雜質干擾。因此，本文采用乙酸乙酯提取，提取液濃縮后，丙酮溶解，固相萃取凈化。

圖2 7種有機磷農藥在不同提取液中提取回收率

4 結論

本法采用提取和固相萃取前處理技術，通過串聯質譜法建立了7種有機磷農藥殘留量的測定和確證方法。本方法具有良好的線性關系、精密度、準確度、回收率和滿意的定量限以及分離效果。目前我國暫無明確規定豆粕中有機磷類農藥殘留限度，通過對實際豆粕樣品檢測，得出該方法適用于檢測豆粕樣品中有機磷類農藥的殘留量，從而為控制豆粕中有機磷類農藥殘留提供有效檢測方法。