六堡茶茶褐素的提取工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)

周 婷,黃文權(quán),謝加仕,張均偉,龔受基,4,*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西桂林 541004;2.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院,廣西欽州 535011;3.梧州中茶茶業(yè)有限公司,廣西梧州543000;4.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(欽州學(xué)院)，廣西欽州 535011)

六堡茶屬于黑茶,產(chǎn)于廣西梧州六堡鄉(xiāng),歷史悠久,其色澤黑褐光潤(rùn),湯色紅濃明亮,滋味醇和,香氣醇陳,以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱,具有清熱利濕、分解油膩、降糖養(yǎng)神的功效。由于其獨(dú)特的保健特性,六堡茶產(chǎn)品逐漸被消費(fèi)者認(rèn)可,擁有的市場(chǎng)份額增加,尤其在傳統(tǒng)市場(chǎng)東南亞國(guó)家的知名度不斷攀升。基于其市場(chǎng)價(jià)值和科研理論價(jià)值,六堡茶也漸漸進(jìn)入了科學(xué)工作者的視野。六堡茶經(jīng)過窖藏,茶葉中的其他多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化成分大幅下降,茶褐素卻顯著增加,顯示出黑茶的獨(dú)特品性。茶褐素是一種水溶性色素,被稱為“黑茶中的黃金”,在改善糖脂代謝、防治糖尿病、減肥降脂、預(yù)防心血管疾病等方面效果顯著,對(duì)改善人體的綜合代謝平衡有著很大的幫助[1-3]。

普洱茶茶褐素的研究比較深入,主要集中在提取工藝、理化分析和功效等方面[4-5]。六堡茶茶褐素相關(guān)研究相對(duì)較少,在提取方法及工藝方面僅見大孔樹脂純化[6]及正交試驗(yàn)法的應(yīng)用[3]。何英姿[3]等采用正交試驗(yàn)法對(duì)六堡茶茶褐素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的工藝為料液比1∶30,提取溫度100 ℃、時(shí)間80 min。響應(yīng)面分析法是一種實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)的方法,近年來在藥物提取和處方工藝的優(yōu)化方面應(yīng)用較多,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該方法優(yōu)化六堡茶茶褐素的提取工藝,比正交試驗(yàn)法更簡(jiǎn)化,更精確,其試驗(yàn)次數(shù)也較少[7],具有操作簡(jiǎn)單、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)[8-9],并適用于多因素、多水平的試驗(yàn)。利用溶劑提取法對(duì)六堡茶茶褐素進(jìn)行提取研究,并對(duì)茶褐素理化性能進(jìn)行分析,以期闡明其化學(xué)組成及特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六堡茶 梧州中茶茶業(yè)有限公司;考馬斯亮蘭G250、牛血清白蛋白(100 g,≥98%) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

XS205電子分析天平 瑞士METTLER公司;80-臺(tái)式離心機(jī) 上海精密儀器儀表有限公司;Epoch酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-tek;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;UV-1800紫外可見光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 六堡茶茶褐素的提取 準(zhǔn)確稱取5 g茶樣,裝入錐形瓶中,并加入蒸餾水,按照茶葉∶蒸餾水=1∶15～1∶55的料液比,將溶液加熱到溫度60～100 ℃,浸提40～120 min,溶液趁熱抽濾(浸提中搖瓶2～5次),濾液減壓濃縮至濾液的1/5～1/10,將上述濃縮液依次用2倍體積的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取2、3、4次,將水層溶液倒入錐形瓶,添加無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%[10],低溫靜置12 h后，在4500 r/min的條件下離心10 min,收集離心所得沉淀。以50 mL蒸餾水溶解離心管中的沉淀,充分溶解后，吸取溶液3 mL于25 mL容量瓶中,用蒸餾水定容。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為單因素實(shí)驗(yàn)考察的主要因素,分別研究3個(gè)因素對(duì)茶褐素提取得率的影響。先固定料液比為1∶35 g/mL,提取時(shí)間為60 min,提取次數(shù)1次,提取溫度分別取60、70、80、90、100 ℃;在確定提取溫度為90 ℃的前提下,固定提取時(shí)間為60 min,提取次數(shù)1次,料液比分別取1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55 g/mL;在確定料液比為1∶35 g/mL、提取溫度為90 ℃較合適的前提下,提取次數(shù)為1次,分別設(shè)定提取時(shí)間為40、60、80、100、120 min。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面分析法 在進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的前提下,分別選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為主要影響因素,考察其對(duì)六堡茶茶褐素提取得率的影響。將提取得率作為因變量,建立三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面法,采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,確定最佳提取工藝條件。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken design

1.2.4 六堡茶茶褐素對(duì)照品的制備 參考文獻(xiàn)[10],稱取10 g茶葉樣品,裝進(jìn)索氏提取器,加100 mL 95%的乙醇提取,直至乙醇液顏色無色。茶渣用10倍量蒸餾水于燒瓶中提取3次,每次1 h,過濾并合并水提液,減壓濃縮至20～30 mL,依次用2倍體積的三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取2、3、4次,每次振蕩混合時(shí)間為3分鐘,靜置分層后放出水層待用。所得水相萃取液于55 ℃,真空度-0.09～-0.10條件下減壓濃縮至20～30 mL左右。加無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%,低溫靜置12 h,抽濾收集沉淀,得到該沉淀即為茶褐素對(duì)照品,沉淀在60 ℃條件下烘干待用。

取以上制備的茶褐素0.3 g,以100 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢?使其全部溶解。配制質(zhì)量濃度為 0.18、0.24、0.30、0.48、0.6 mg/mL的茶褐素對(duì)照品溶液,蒸餾水為空白,精確吸取150 μL溶液注入96孔板,用酶標(biāo)儀于270 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,每次做3個(gè)平行。以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、以吸光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性分析,方程為Y=0.8451X+0.1408,相關(guān)系數(shù)R2=0.9995,質(zhì)量濃度在 0.18～0.60 mg/mL范圍內(nèi)與吸光值間呈良好的線性關(guān)系。

1.2.5 茶褐素提取得率的測(cè)定 用酶標(biāo)儀在270 nm下,蒸餾水為空白,以上述制備茶褐素對(duì)照品做標(biāo)準(zhǔn)[10],精確吸取150 μL溶液注入96孔板,測(cè)定溶液的吸光度,每次做3個(gè)平行,計(jì)算茶褐素提取得率。

式中,A為270 nm下測(cè)定的吸光值;n為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.6 六堡茶茶褐素理化成分分析 pH測(cè)定采用pH計(jì)法[11],取茶褐素樣品配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、1%、5%的溶液,用pH計(jì)測(cè)定;總酸性基測(cè)定參照文獻(xiàn)[5]操作;蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[12-13];茶多糖測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)六堡茶茶褐素提取得率的影響 不同料液比對(duì)六堡茶茶褐素提取得率的影響如圖1,料液比在1∶15～1∶35 g/mL時(shí),提取得率呈上升趨勢(shì),而料液比在1∶35～1∶55 g/mL時(shí)，茶褐素提取得率下降。這是因?yàn)?，隨著溶劑的增多,茶葉與溶劑之間能充分接觸,有利于茶褐素的溶出;當(dāng)料液比增加到1∶35 g/mL時(shí),茶褐素充分溶出,繼續(xù)增加溶劑比例后,茶褐素的溶出受茶葉中其他成分的抑制反而不利于提取[15],考慮到過多提取溶劑的添加會(huì)增加濃縮的工作量,過少又會(huì)使茶褐素提取不完全而導(dǎo)致原料浪費(fèi),所以將料液比定為1∶35 g/mL比較合適。

圖1 料液比對(duì)茶褐素提取得率的影響Fig.1 The effect of material-to-liquid ratio on yield of theabrownin

2.1.2 提取溫度對(duì)六堡茶茶褐素提取得率的影響 溫度對(duì)六堡茶茶褐素提取得率的影響如圖2,提取溫度在60～90 ℃時(shí),隨著提取溫度的升高,茶褐素的提取得率明顯增加;提取溫度為90 ℃時(shí)，提取得率達(dá)到最高；超過90 ℃時(shí),隨著溫度的升高,茶褐素提取得率呈下降趨勢(shì)?？紤]到升高溫度,可能會(huì)破壞茶褐素的結(jié)構(gòu),影響其生物活性,故采用提取溫度為90 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)茶褐素提取得率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on yield of theabrownin

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)六堡茶茶褐素提取得率的影響 提取時(shí)間對(duì)六堡茶茶褐素提取得率的影響如圖3,提取時(shí)間的增加對(duì)提高六堡茶茶褐素提取得率的效果較為明顯,在40～80 min范圍內(nèi),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),茶褐素提取得率增加,提取時(shí)間超過80 min后,茶褐素提取得率基本恒定?？紤]到提取時(shí)間延長(zhǎng),除茶褐素外的其他成分也會(huì)溶出,而且能耗增加,成本提高,故將提取時(shí)間定為80 min比較合適。

圖3 提取時(shí)間對(duì)茶褐素提取得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on yield of theabrownin

2.2 響應(yīng)面法對(duì)茶褐素提取工藝的分析

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取料液比、溫度、時(shí)間3個(gè)因素的合適水平,對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析,設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken design

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

固定一個(gè)變量于“0”水平,作另外2個(gè)變量與提取得率的響應(yīng)面圖見圖4。由3組曲面響應(yīng)面圖比較結(jié)果可知，提取溫度與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面圖表現(xiàn)為最陡峭的曲面,因此這兩個(gè)因素交互作用對(duì)茶褐素提取得率的影響最為顯著;料液比與提取溫度的響應(yīng)曲面圖表現(xiàn)為較陡峭的曲面,對(duì)茶褐素提取得率的影響較為顯著;料液比與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面圖表現(xiàn)為較平滑的曲面,對(duì)茶褐素提取得率的影響最小。通過Design-Expert 8.0.6實(shí)驗(yàn)軟件分析,最優(yōu)提取方案為:料液比1∶37.32 g/mL,提取溫度95.89 ℃,提取時(shí)間85.67 min;理論預(yù)測(cè)值茶褐素提取得率為10.38%。為便利實(shí)際操作,將上述條件修正為:料液比1∶37 g/mL,提取溫度96 ℃,提取時(shí)間86 min。

圖4 各因素的交互作用對(duì)提取得率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of interaction of various factors on the yield of the abrownine

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化六堡茶茶褐素提取工藝的有效性,在優(yōu)化的提取條件下重復(fù)3次試驗(yàn),以期考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果的吻合程度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茶褐素提取得率為10.33%±0.04%,而預(yù)測(cè)提取得率為10.38%,兩者基本一致,說明回歸方程與實(shí)際情況擬合很好,在茶褐素的提取工藝上具有一定的指導(dǎo)意義。采用溶劑提取法得到六堡茶褐素的提取得率為10.33%±0.04%,與文獻(xiàn)[16]相比略高。六堡茶水溶性茶褐素易與蛋白質(zhì)、茶多糖等高分子物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物,其含量高低可能取決于原料、工藝、陳化時(shí)間、提取工藝等因素,所以導(dǎo)致多個(gè)研究結(jié)果存在差異[5,16-18]。

2.4 六堡茶水溶性茶褐素的理化成分分析

六堡茶水溶性茶褐素中富含羧基、甲基、羥基、氨基,其酸堿性取決于酸堿基團(tuán)的數(shù)目、電離常數(shù)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、1%、0.1%的茶褐素溶液pH稍有差異,且濃度越小,pH越接近中性,濃度變稀,一方面電離常數(shù)變大使氫離子濃度有增大趨勢(shì),另一方面酸性基團(tuán)數(shù)目減少使氫離子濃度有減少趨勢(shì),在這過程中可能酸性基團(tuán)數(shù)目減少占優(yōu)勢(shì),導(dǎo)致pH隨茶褐素濃度減少而升高,但總體上茶褐素呈弱酸性,與文獻(xiàn)[19]記載一致。茶褐素中總酸性基為(5.5±0.02) mmol·g-1,其中羧基(1.34±0.05) mmol·g-1,酚羥基(4.16±0.04) mmol·g-1,主要以酚羥基為主,占75.6%,六堡茶水溶性茶褐素的酸性貢獻(xiàn)主要來源于酚羥基,結(jié)果與秦誼等[11]報(bào)道的一致。

表4 濃度與pH關(guān)系Table 4 Relationship of concentration and pH

表5 成分測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of constituents

采用考馬斯亮藍(lán)法,以牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=47.143X-0.5889(R2=0.9997),其中X為牛血清白蛋白含量,Y為溶液吸光度,測(cè)得六堡茶茶褐素中蛋白質(zhì)的含量為(15.45±0.06)%,與文獻(xiàn)相近[19]。

茶多糖的測(cè)定以麥芽糖為標(biāo)準(zhǔn),回歸方程為:Y=0.0714X+18.403(R2=0.9994),其中X為麥芽糖含量,Y為溶液吸光度,測(cè)得多糖含量為(25.16±0.11)%。茶多糖在茶褐素中比重較大,超過20%,其不但是茶湯呈甜味的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[20],而且可能是生理活性的作用位點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了響應(yīng)面法研究,六堡茶茶褐素最佳提取方案為料液比1∶37 g/mL,提取溫度96 ℃,提取時(shí)間86 min,理論預(yù)測(cè)茶褐素提取得率為10.38%,實(shí)際實(shí)驗(yàn)值為10.33%±0.04%。影響六堡茶茶褐素提取得率的各因素影響大小排列次序依次為提取溫度>提取時(shí)間>料液比。

茶褐素提取得率除與廠家、原料、加工工藝、陳化時(shí)間、主觀因素和測(cè)定方法等不同外,采用黃意歡的系統(tǒng)分析法測(cè)定數(shù)據(jù)時(shí),六堡茶的茶褐素從19.31%～38.16%不等[21-22],普洱茶的茶褐素含量從7.23%～12.76%[23],雅安藏茶中茶褐素含量從3.20%～14.86%不等[24-25]。利用該測(cè)定方法測(cè)定30個(gè)典型普洱茶樣品茶褐素含量,茶褐素含量范圍在5.28%～9.73%之間,相對(duì)傳統(tǒng)方法測(cè)定值7.36%～11.81%略低[10]。本文測(cè)定六堡茶茶褐素采用上述方法,茶褐素提取得率為10.33%±0.04%,與傳統(tǒng)方法測(cè)定的茶褐素含量相近,而與該法測(cè)定的普洱茶茶褐素值略高,從理論和趨勢(shì)上與上述文獻(xiàn)吻合。利用響應(yīng)面分析法對(duì)六堡茶茶褐素的提取進(jìn)行研究,并對(duì)茶褐素的理化性能進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其與普洱茶比較略有差異,六堡茶水溶性茶褐素的酚羥基占75.6%,普洱茶中酚羥基占88%,其三種濃度的平均pH為6.29,比六堡茶pH5.93略大[19],其原因可能與加工原料和加工工藝有關(guān),導(dǎo)致其物質(zhì)轉(zhuǎn)化出現(xiàn)差異[26],但兩者都具有黑茶的共同特征。