利用Saccharomyces cerevisiae KD控制蘋果汁中棒曲霉素的污染

朱瑞瑜,陳水鋁,黃聰輝,樓芳菲,尤玉如,馬莉莉

(1.浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江杭州 310023;2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江杭州 310023;3.Coalescence,LLC,美國俄亥俄州 43219)

據美國農業部(USDA)官網2017年的報道,全世界每年大約有25%的農作物受到真菌毒素的污染;真菌毒素污染成為我國農產品出口歐盟的最大阻礙[1-2]。棒曲霉素是自然界中一種常見的真菌毒素,廣泛存在于水果、蔬菜、谷物、海鮮、堅果及其制品中。棒曲霉素對細菌、酵母、植物、哺乳動物以及人類均有毒害作用[3]。短時間內大量攝入棒曲霉素會引起急性中毒,表現為惡心、嘔吐,腸胃功能紊亂、膀胱和肝臟等器官病變等;慢性中毒包括誘發腫瘤、致癌、致畸及潛在的遺傳毒性等[4-6]。雖然各國家和地區設立了棒曲霉素在食品中的限量標準,但棒曲霉素的污染依然較為普遍。2017年中國的一次抽檢結果顯示,在由果汁、果干、果醬組成的137個樣品中,棒曲霉素的檢出率為31%,超標率為17.5%[7]。

微生物法被認為是一種有效去除棒曲霉素的方法之一。近幾年來,已分離得到多種可去除棒曲霉素的菌株,比如Candidaguilliermondii[8]、Sporobolomycessp[9]、Rhodosporidiumpaludigenum[10]、Rhizopusisolates[11]以及Pichiacaribbica[12]等。然而,這些已報道的微生物中,絕大多數并非食品生產用微生物,因而無法直接應用到食品中。

本文研究了食品生產用微生物SaccharomycescerevisiaeKD對棒曲霉素的去除作用,并將其應用到被棒曲霉素污染的市售100%蘋果汁中,發酵2 d后對發酵蘋果汁的品質進行了評價,以期為降低果汁中棒曲霉素的污染提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

商業化葡萄酒釀造菌株(SaccharomycescerevisiaeVitilevure KD) 法國Martin Vialatte;乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.cremorisMG1363) 德國MoBiTec;氫氧化鈉、沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、酚酞指示劑 國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸(>99.0%)、無水乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、醋酸鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NYDB液體培養基(8 g牛肉浸膏、5 g酵母浸出粉和10 g葡萄糖溶于1 L蒸餾水);MRS培養基 杭州微生物試劑有限公司;100%蘋果汁 北京匯源食品飲料有限公司。

Waters 2695液相制備色譜 美國Waters;SpectraMax M3多功能酶標儀 美國Molecular Devices;NDK-12W水浴氮吹儀 上海皓莊(LNB)儀器有限公司;SW-CJ-1FD凈化工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠司;BSP-250生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;BS-IEA振蕩培養箱 國華電器有限公司;手持折光儀 上海儀電物理光學儀器有限公司;Milli-Q Academic超純水儀 美國Milli-pore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1S.cerevisiaeKD對棒曲霉素的去除作用 將活化兩代的S.cerevisiaeKD接種于無菌NYDB液體培養基中,使其菌體起始濃度為107CFU/mL,同時加入棒曲霉素,使培養基中棒曲霉素濃度分別為0、1 mg/L(0為對照組)。將樣品置于28 ℃、150 r/min的搖床中培養,分別在培養12、16、20、24、28 h后,離心取上清液,檢測培養液中棒曲霉素的含量。

1.2.2 滅活和活體S.cerevisiaeKD菌體對棒曲霉素的去除作用 在28 ℃、150 r/min振蕩條件下大量培養S.cerevisiaeKD,48 h后將菌液等量分成兩組,其中一組于85 ℃水浴30 min,滅活酵母;另一組不做任何處理。分別向兩組菌液以及無菌NYDB培養基(作為對照)中加入等量的棒曲霉素,使得體系中棒曲霉素濃度為5 mg/L。將上述處理置于28 ℃、150 r/min振蕩培養,培養1、3 d后分別檢測菌液中棒曲霉素的殘留量。

1.2.3 棒曲霉素起始濃度和菌體起始濃度對S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 向無菌NYDB液體培養基中加入棒曲霉素,使得棒曲霉素起始濃度分別為1、10、30、50 mg/L;將S.cerevisiaeKD接種到上述培養基中,接種量為107CFU/mL;以含等量棒曲霉素但不含S.cerevisiaeKD的培養基作為對照。將樣品置于28 ℃、150 r/min的搖床中培養,分別在培養12、24、36 h后，檢測培養液中棒曲霉素的含量。

將S.cerevisiaeKD接種到NYDB液體培養基中,起始接種量分別為0、105、106、107CFU/mL(0為對照組);向上述培養基中加入棒曲霉素,使其起始濃度為5 mg/L。將樣品置于28 ℃、150 r/min的搖床中培養,分別在培養6、12、24、36 h后，檢測培養液中棒曲霉素的含量。

1.2.4 培養基pH對S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 用NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)將NYDB培養基的pH分別調至4.0、5.0、6.0、7.0。將活化好的S.cerevisiaeKD分別接種到上述不同pH的培養基中,接種量為0、107CFU/mL(0為對照),培養基中棒曲霉素起始濃度為5 mg/L。將96孔板置于28 ℃恒溫培養箱中培養48 h,每隔3 h測定菌體吸光值(OD600),并分別在12、24、36、48 h檢測培養液中棒曲霉素的含量。

1.2.5S.cerevisiaeKD對棒曲霉素的耐受力 將活化兩代的S.cerevisiaeKD接種到含NYDB培養基的96孔板中,使得培養基中起始菌體濃度為107CFU/mL,棒曲霉素的起始濃度分別為0、3、5、10、50、100 mg/L。將96孔板置于28 ℃恒溫培養箱中培養33 h,每隔3 h測定菌體吸光值(OD600)。

1.2.6S.cerevisiae和L.lactis對蘋果汁中棒曲霉素的去除作用及發酵果汁的品質評估 本課題組前期研究發現,L.lactisMG1363能夠有效去除液體中的棒曲霉素(數據未顯示)。將S.cerevisiae和L.lactis混合接種于市售100%蘋果汁中(棒曲霉素起始濃度為5 mg/L),并設置不同的處理對蘋果汁進行發酵。處理一:兩菌株初始濃度均為5×106CFU/mL,樣品置于33 ℃、120 r/min的搖床中培養48 h;處理二:5×106CFU/mL的S.cerevisiae置于28 ℃、120 r/min的搖床中培養24 h后,加入5×106CFU/mL的L.lactis,樣品置于33 ℃、120 r/min的搖床中繼續培養24 h;處理三與處理二相同,但全程均為靜置培養;處理四:兩菌株起始濃度均為5×106CFU/mL,樣品置于33 ℃、120 r/min的搖床中培養24 h后,繼續靜置培養24 h。除了處理三外,其余樣品在培養前均添加9%蔗糖。培養結束后,對樣品中棒曲霉素的殘留量進行了測定,并對發酵蘋果汁的品質進行了評估,主要檢測了樣品中的可溶性固形物、酸度、黃酮和總酚的含量。

1.2.7 指標測定方法

1.2.7.1 發酵后蘋果汁品質指標測定 利用手持折光儀檢測可溶性固形物;總酸的測定參考國標GB/T 12456-2008[13]的方法進行,最后結果以蘋果酸表示(蘋果酸換算系數為0.067);總酚的檢測參照國標GB/T 31740.2-2015[14]的方法進行;黃酮含量的檢測參照鄭亞美等[15]的方法進行。設置未經任何處理的市售100%純蘋果汁作為對照。

1.2.7.2 棒曲霉素的提取與檢測 棒曲霉素的提取方法:向待測溶液中加入等體積乙酸乙酯,于180 r/min小搖床中震搖 3 h后,于3000 r/min轉速下離心3 min,收集有機相并于40 ℃水浴下進行氮吹,用AABS緩沖液(0.45 mL冰醋酸、0.15 g醋酸鈉溶解于40 mL雙蒸水中,調整pH至4.0)溶解、過濾,待用。

棒曲霉素含量檢測參考Zhu等[16]的方法并進行適當修改:采用高效液相色譜系統,選取C-18反向色譜柱(Phenomenex 250×4.6 mm,5 μm,USA),流動相為水(0.04%乙酸,v/v)和乙腈90∶10(v/v),流速1 mL/min。檢測波長為276 nm,柱溫恒定為35 ℃,進樣量為20 μL。

棒曲霉素去除率(%)=(對照組棒曲霉素含量-處理組棒曲霉素含量)/對照組棒曲霉素含量×100

通過繪制標準曲線獲得的棒曲霉素含量計算公式如下:

x=(y+605.71)/135.87,R2=0.9999;其中,x為棒曲霉素含量(μg/L),y為峰面積。

1.3 數據處理

測定菌體吸光值實驗中每個處理設置6個平行,其他實驗中每個處理設置3個平行,每組實驗重復3次。采用SPSS軟件22.0進行數據分析;采用ANOVA進行鄧肯氏差異分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 S. cerevisiae KD對棒曲霉素的去除作用

2.1.1S.cerevisiaeKD在NYDB培養基中對棒曲霉素的去除作用S.cerevisiaeKD可以有效降低培養基中棒曲霉素的含量,結果如表1所示。有氧培養12 h后,S.cerevisiaeKD對棒曲霉素的去除率為74.9%;培養28 h后，培養基中已檢測不到棒曲霉素。Moss等[17]利用S.cerevisiae71B降解棒曲霉素,發現在有氧條件下培養100 h后,棒曲霉素含量只減少了約20%。因此,本研究中選用的S.cerevisiaeKD在有氧條件下，可高效去除培養基中的棒曲霉素。為探尋S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的機理,本研究比較了滅活酵母和活體酵母對棒曲霉素含量的影響,結果如圖1所示。

表1 S. cerevisiae KD在NYDB培養基中對棒曲霉素的去除率Table 1 Patulin reduction rate by S. cerevisiaeKD in NYDB medium

2.1.2 滅活和活體S.cerevisiaeKD菌體對棒曲霉素的去除作用 由圖1可知,滅活酵母可降低溶液中棒曲霉素的含量,由此推斷S.cerevisiaeKD對棒曲霉素有物理吸附作用。在相同的培養條件下,活體酵母對棒曲霉素的去除率明顯高于滅活酵母:培養1 d時,活體酵母對棒曲霉素的去除率為79.35%,而滅活酵母去除率僅為21.92%;培養3 d后,活體酵母去除率達到97.82%,滅活酵母去除率沒有顯著變化(p>0.05)。此外,S.cerevisiaeKD在本實驗前期已培養了48 h,達到了穩定期,酵母菌體不再進行數量上的增長,但隨著培養天數的增加，活體酵母組的棒曲霉素濃度出現了顯著的下降(p<0.05),從而推斷S.cerevisiaeKD可以酶解棒曲霉素。由此可知,S.cerevisiaeKD既能物理吸附棒曲霉素,又能生物降解棒曲霉素。酵母細胞壁中的蛋白質與多糖和菌體吸附棒曲霉素緊密相關,而菌體表面的疏水作用在吸附棒曲霉素的過程中，也發揮著至關重要的作用[18]。雖然目前已證實，不少微生物可以生物酶解棒曲霉素,然而迄今為止,尚未有報道分離純化得到微生物降解棒曲霉素的相關酶類[9,16]。

圖1 滅活和活體S. cerevisiae KD菌體對棒曲霉素的去除作用(NYDB培養基中)Fig.1 Patulin reduction by inactivated and viable cells of S. cerevisiae KD in NYDB medium注:“*”表示同一處理下3 d與1 d的降解率相比有顯著差異(p<0.05)。

2.1.3 棒曲霉素起始濃度和菌體起始濃度對S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 棒曲霉素起始濃度對S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響如圖2所示,當棒曲霉素濃度高達50 mg/L,S.cerevisiae依然可有效去除棒曲霉素。培養24 h后,棒曲霉素濃度為1、10、30、50 mg/L處理組的去除率分別為93.8%、83.7%、65.7%和58.4%。S.cerevisiaeKD對棒曲霉素的去除率隨起始棒曲霉素濃度升高而降低,這和棒曲霉素對酵母有毒性相關[3]。

圖2 棒曲霉素起始濃度對S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影響(NYDB培養基中)Fig.2 Influence of initial patulin concentration on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

酵母起始濃度越高,在初始階段對棒曲霉素的去除效率越高(圖3)。當S.cerevisiaeKD濃度為106、107CFU/mL時,其對棒曲霉素的去除率明顯高于酵母濃度為105CFU/mL的處理組。但當培養時間達到36 h時,各組棒曲霉素的去除率均趨于100%。隨著菌體的生長和對棒曲霉素環境的適應,在培養后期較高的菌體起始濃度處理組不一定在棒曲霉素降解能力上呈現優勢。Cao等[19]發現,當酵母起始濃度為109CFU/mL 時,培養15 d后其降解效果低于起始濃度為5×108CFU/mL的處理組。

圖3 酵母起始濃度對S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影響(NYDB培養基中)Fig.3 Influence of initial yeast concentration on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

2.1.4 培養基pH對S.cerevisiaeKD去除棒曲霉素的影響 由圖4可知,當起始pH在4.0～6.0之間時,S.cerevisiae對棒曲霉素有較好的去除效果。而不同pH下菌株的生長曲線(圖5)表明,S.cerevisiae在pH為5.0和6.0的培養基中時,生長狀態較佳,由此可見,菌體去除棒曲霉素的能力和生長狀態有相關性。

圖4 NYDB培養基pH對S. cerevisiae KD去除棒曲霉素效率的影響Fig.4 Influence of pH value on patulin reduction efficiency by S. cerevisiae KD in NYDB medium

圖5 NYDB培養基pH對S. cerevisiae KD生長的影響Fig.5 Influence of pH value on the growth of S. cerevisiae KD in NYDB medium

2.2 S. cerevisiae KD對棒曲霉素的耐受力

不同濃度的棒曲霉素對S.cerevisiaeKD生長的影響如圖6所示。當棒曲霉素濃度在3～100 mg/L范圍內,S.cerevisiaeKD均能生長。在低棒曲霉素濃度(0～5 mg/L)下,菌體的生長并未受到明顯的影響。當培養基中棒曲霉素的濃度為10 mg/L時,菌體的生長受到輕微抑制。據報道,棒曲霉素能破壞細胞膜和蛋白質結構的完整性,對酵母產生毒害作用,當棒曲霉素濃度為8 mg/L 時,能完全抑制酵母Schizosaccharomycespombe的生長[20]。而在本實驗中,當棒曲霉素濃度低于10 mg/L時,S.cerevisiaeKD的生長并未受到明顯影響;當棒曲霉素濃度高至50 mg/L時,菌體的生長受到明顯抑制。然而,菌體在棒曲霉素濃度高達100 mg/L時依然能生長。因此推測,菌體可能通過降解棒曲霉素來增強自身對棒曲霉素的耐受力,這與Castoria等的報道相符[21]。此外,Ianiri等[22]推測,棒曲霉素的生物降解由多個步驟組成,包括起始時菌體被激發起對棒曲霉素的耐受力。

圖6 S. cerevisiae對棒曲霉素的耐受力(NYDB培養基中)Fig.6 Tolerance of S. cerevisiaeto patulin in NYDB medium

2.3 S. cerevisiae KD和L. lactis MG1363 在蘋果汁中對棒曲霉素的降解及發酵作用

在前期的實驗基礎上,設置4個處理組,利用S.cerevisiaeKD和L.lactisMG1363對蘋果汁進行混合發酵,2 d后對所有處理組中的棒曲霉素含量進行檢測,發現棒曲霉素均已被完全降解。

進一步對發酵液中的總可溶性固形物、酸度、黃酮含量、總酚含量進行了檢測。由表2可知,處理組三中可溶性固形物發生了顯著下降(p<0.05),而其他處理組由于在發酵前添加了9%蔗糖,因而其可溶性固形物與純蘋果汁相比差異不大,甚至略有升高。同對照組相比,發酵后處理組一、二、三、四的酸度分別增加了1.3%、1.3%、1.2%、0.9%。酚類對果蔬的成熟衰老、抗病性、抗逆性均有重要影響,并有清除自由基、改善心血管疾病、抗發炎等活性[23]。4個處理組中總酚含量分別比對照上升了24%、37%、29%、42%。然而,發酵前后蘋果汁中黃酮的含量沒有發生顯著變化。目前,已知的微生物降解棒曲霉素的產物主要有ascladiol和desoxypatulinic acid[24],而S. cerevisiae降解棒曲霉素的產物為ascladiol[17]。據報道,棒曲霉素有較強的細胞毒性,而其降解產物ascladiol對人體的肝臟細胞、膀胱細胞、小腸細胞等均無細胞毒性[25]。本文利用S.cerevisiaeKD和L.lactis對蘋果汁進行發酵,不僅控制了棒曲霉素的污染,去除了毒素的毒性,而且提高了蘋果汁中的總酚含量,增加附加值。通過添加一定的風味物質并進行感官評定,可進一步改善發酵果汁的口感,為菌株在被棒曲霉素污染的蘋果汁上的商業化應用打下基礎。

表2 發酵蘋果汁的品質評估Table 2 Quality assessment of fermented apple juice

3 結論

棒曲霉素是自然界中主要的真菌毒素之一,尤其在水果、谷物及其制品中較為常見。本研究表明,S.cerevisiaeKD在NYDB培養基和市售100%蘋果汁中，均能高效控制棒曲霉素的污染,且酵母的起始濃度、棒曲霉素的起始濃度、環境pH等因素對酵母去除棒曲霉素的效率有一定程度的影響。S.cerevisiaeKD對棒曲霉素的耐受力較強,在棒曲霉素濃度高達100 mg/L的環境下依然能較好生長。利用S.cerevisiaeKD和L.lactisMG1363對蘋果汁進行聯合發酵,不僅能完全去除蘋果汁中棒曲霉素的污染,還能增強果汁的營養價值。因此,本文的研究結果為控制蘋果汁中棒曲霉素的污染、保證食品安全,提供新的途徑。