食管鱗癌組織MTA2、CD34的表達及其臨床意義

高潔 王居平 朱名毅 盧露碧 李日著

1右江民族醫學院病理生理學教研室（廣西百色 533000）；2右江民族醫學院附屬醫院心胸血管外科（廣西百色 533000）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其病死率位居我國惡性腫瘤患者的第四位，以鱗狀細胞癌最為常見[1]，死因主要為腫瘤細胞的浸潤和轉移[2]。CD34是一種與新生血管內皮細胞增殖有關的蛋白，常作為腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的標志物[3]，而MVD則是腫瘤血管生成的重要標志。大量研究證實，血管生成在食管癌發生發展和浸潤轉移中發揮著極其重要的作用[4-5]。腫瘤轉移相關基因2（metastasis?associated gene 2，MTA2）屬于腫瘤轉移相關基因的家族成員，其在胰腺癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中表達均增強，且與腫瘤的浸潤、轉移密切相關[6-7]，但有關MTA2與食管癌血管生成相關性方面的研究，在國內外尚未見相關報道。本研究應用免疫組織化學法檢測ESCC組織及正常食管組織中的MTA2和CD34的表達，探討二者與ESCC患者臨床病理參數之間的關系，為ESCC的轉移機制及抗ESCC血管生成治療提供理論及實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集百色市右江民族醫學院附屬醫院2013年1月至2016年12月期間手術切除的80例患者標本蠟塊，均為ESCC組織（觀察組），同時選取胃鏡檢查活檢標本中正常食管黏膜組織30例（對照組），患者術前未進行放化療等針對腫瘤的特殊治療。所有標本均由兩位有經驗的病理醫師診斷。其中男46例，女34例，平均58歲。術后病理分期參照國際抗癌聯盟的TNM分期標準[8]：Ⅰ+Ⅱ期42例，Ⅲ+Ⅳ期38例；分化程度：低分化28例，中分化32例，高分化20例；淋巴結轉移：有38例，無42例；浸潤程度：T1?T235例，T3?T445例。

1.2 主要試劑濃縮型山羊抗人抗體MTA2（Santa Cruz公司，USA）；抗山羊IgG聚合物（北京中杉金橋生物技術有限公司）；鼠抗人CD34單克隆抗體及免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測MTA2和CD34表達將選取好的石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復，分別加入MTA2抗體（1∶500）、CD34抗體覆蓋切片，滴加相應二抗，孵育后在切片上滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色，經梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，用中性樹膠封片，陰性對照用PBS緩沖液。

1.3.2 結果判定MTA2陽性表達主要位于ESCC細胞核中，呈現棕黃色或棕褐色顆粒，每張切片在高倍鏡（×40）下隨機選取10個不同視野進行觀察，使用雙評分法進行結果判定[9]。（1）計數陽性細胞所占比例標準：5%以下記為0分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，75%以上記為4分；（2）按細胞染色程度計分：無染色的記為0分，呈淡黃色記為1分，呈棕黃色記為2分，呈棕褐色記為3分。（1）和（2）乘積評分≤ 1分記為陰性（-），2～4分記為弱陽性（+），5～7分記為中等陽性（++），≥8分記為強陽性（+++）。CD34陽性表達者血管內皮細胞質呈棕色或棕黃色。MVD計數方法[8]：選取高倍鏡視野（400倍）內最高微血管密度區3個，計數微血管的數目，取平均值后算出MVD值，結果以表示。結果判定均由兩位以上高年資病理科醫生審核。

1.4 統計學方法采用統計學軟件SPSS 20.0對所有數據進行分析，MTA2和CD34表達的相關性采用Spearman等級相關系數，定量指標采用描述，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 ESCC和正常食管組織中MTA2和CD34的表達在ESCC組織中MTA2呈強陽性表達，主要表達于細胞核中，著色為棕褐色，陽性率為85%，且有較多的核分裂像（圖1A），在正常食管組織中MTA2呈陰性表達（圖1B）。ESCC組織中MVD值（41.7±1.8）顯著高于正常食管組織的MVD值（12.3± 1.1）（P＜ 0.01），見表1。

圖1 免疫組化檢測MTA2在ESCC組織和正常食管黏膜組織中的表達（×40）Fig.1 Immunohistochemical staining analysis of MTA2 expression in ESCC tissues and normal esophageal mucosa tissues（× 40）

表1 ESCC組織和正常食管黏膜組織中MTA2、CD34的表達Tab.1 The expressions of MTA2 and CD34 in ESCC tissues and nomal esophageal mucosa tissues

2.2 MTA2、CD34表達與ESCC臨床病理特征的關系本課題組前期研究結果表明，MTA2陽性表達與浸潤深度、淋巴結是否轉移及TNM分期密切相關[10]，且呈正相關，與分化程度呈負相關（r=-0.645，P＜0.05），而與患者的年齡、腫瘤大小無關（P＞0.05）。ESCC組織中MVD與組織大小、浸潤深度、TNM分期、分化程度及淋巴結是否轉移有關（P＜0.05），而與患者的年齡無關（P＞0.05）。見表2。

2.3 ESCC組織中MTA2表達與MVD的相關性Spearman等級相關性檢驗分析表明，在ESCC組織中，MTA2的陽性表達與MVD呈正相關（r=0.777，P＜ 0.01）。

表2 MTA2、CD34表達與ESCC患者臨床病理參數的關系Tab.2 The relationship between MTA2 and CD34 expressions and clinical pathological parameters of esophageal squamous cell carcinoma patients

3 討論

食管癌發病率、病死率正逐年升高，腫瘤細胞的浸潤、轉移是中晚期食管癌患者主要的死亡原因[2]。多項研究表明腫瘤細胞的浸潤和轉移需要形成大量的血管[3-4]，而新生的腫瘤血管可通過提供營養和轉移的路徑誘發原發腫瘤的浸潤生長。因此，明確腫瘤血管在惡性腫瘤浸潤轉移過程中的作用機制，尋找抗腫瘤血管生成的治療方法，已成為治療惡性腫瘤的重要策略。

MTA2是具有核小體重塑活性的組蛋白去乙酰基酶（nucleosomeremodeling deacetylase，NuRD）的重要組成部分，主要通過抑制NuRD的活性來阻止基因轉錄，并通過調節細胞凋亡、細胞骨架和雌激素通路等途徑促進惡性腫瘤的侵襲和轉移[11]，是近年的研究熱點。國內外研究顯示，MTA1與多種惡性腫瘤血管生成密切相關[12-14]，HIROAKI等[15]研究發現在ECSS組織中，MTA1與CD34的表達呈正相關，其誘導的HIF?1α/VEGF是血管生成的關鍵因子，而MTA1與MTA2均屬于MTAs家族成員，二者在蛋白結構上有65%的同源性，提示MTA2可能具有與MTA1相似的生物學功能。本研究發現MTA2在ESCC組織中高表達，且MTA2在細胞核中表達越高，ESCC細胞分化程度越低，說明MTA2表達上調是促進食管癌發生發展的一個重要因素。伴有淋巴結轉移的ESCC組織中MTA2表達顯著高于無淋巴結轉移組織；在TNM分期中，Ⅲ+Ⅳ期的ESCC組織中MTA2表達高于Ⅰ+Ⅱ期組織，說明MTA2作為癌基因促進ESCC細胞的侵襲與轉移。

研究表明，新生血管形成在多種惡性腫瘤的生長、侵襲和轉移中發揮著重要的作用，而MVD是評估腫瘤血管生成的金標準[16-18]。在本研究中，CD34在ESCC中呈陽性表達，ESCC組織中MVD與腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關，說明MVD與ESCC浸潤與轉移密切相關。在ESCC組織中，MTA2表達與MVD呈正相關（r=0.777，P＜0.01），MTA2表達越高的ESCC組織中MVD值也越高，提示MTA2與ESCC新生血管生成密切相關。筆者推測，MTA2可能通過誘導血管生成使ESCC細胞獲得更具侵襲性表型而增強ESCC侵襲和轉移能力，但具體機制尚不明確。下一步研究將采用RNA干擾技術特異性的下調ESCC細胞中MTA2表達，并通過質粒轉染過表達MTA2，探討MTA2對ESCC細胞侵襲和轉移的影響及血管生成在以上生物學現象中的作用。

綜上所述，MTA2和CD34表達與ESCC侵襲和轉移的密切相關，聯合檢測MTA2和CD34的表達可能為診斷ESCC轉移提供重要依據，并可能成為抗ESCC血管生成治療提供新的靶點。