MAPK信號通路及STAT3、STAT5A/B在銀屑病皮損中表達增高

劉鳳杰 栗玉珍

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院皮膚科（哈爾濱150001）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，病因復雜，主要由遺傳、免疫、環境相互作用引起，病理表現為皮膚淋巴細胞浸潤、表皮增生及角化不全[1]。有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）是一種重要的生長信號調節蛋白，在細胞增殖、分化、凋亡、應激、炎癥以及免疫反應等多種生理和病理過程發揮重要作用[2]。研究較為廣泛的通路為p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和c?Jun氨基末端激酶（c?Jun N?terminal kinase，JNK）。

信號傳導及轉錄激活因子3（signal transduc?ers and activators of transcription 3，STAT3）、STAT5A/B、蛋白 S6激酶 1（170 kDa ribosomal proteinS6 ki?nase，p70S6k）、核因子?кB（nuclear factor?кB，NF?кB）、鈣反應元件結合蛋白（cyclic?AMP response?binding protein，CREB）均屬于MAPK下游的相關因子。ERK1/2影響細胞增殖、分化，作用于NF?кB直接調控相關基因表達[3]。CREB是Ras/ERK、P13激酶/AKt、應激狀態誘導的p38 MAPK通路等的磷酸化底物，參與細胞形態變化[4]。Akt與Erk1/2均可以作用于p70S6K及真核啟動因子調節下游蛋白質的表達，與惡性腫瘤的發生發展相關[5]。在腫瘤炎性微環境中，Src家族激酶（Src family ki?nase，SFK）可通過激活 MAPK（包括 JNK、p38、ERK1/2等）通路上調STAT3的磷酸化水平[6]。

目前研究表明部分因子在銀屑病發病機制中發揮重要作用，但存在各種不同結果。本文以MAPK信號通路相關的9種因子p38、ERK1/2、Akt、STAT3、STAT5A/B、JNK、p70S6k、NF?кB、CREB 為研究對象，檢測它們在銀屑病皮損中的具體蛋白表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料所有尋常型銀屑病皮損于2017年3-9月在哈爾濱醫科大學附屬第二醫院皮膚科收集，共27例（銀屑病組），其中女13例，男14例，年齡10～74歲，平均（36.3±17.2）歲。平均皮損面積和嚴重程度指數（PASI）評分為（6.46±3.7）分。局部麻醉（1%利多卡因）后，以手術切取法從每例患者皮損處取出至少4 mm的活檢組織，并將其儲存在液氮中。受試者在皮膚活檢前至少2周未接受局部治療，至少1個月未接受全身免疫抑制治療，3個月內未接受系統維A酸類藥物治療。另外，同時收集哈爾濱醫科大學附屬第二醫院進行整形手術的正常皮膚組織（4～10 mm）19例作為對照組。女13例，男6例，年齡13～68歲，平均（34.5±15.0）歲。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會及所有患者或監護人（18歲以下患者）簽署知情同意書。

1.2 主要試劑Multi?Pathway 9?plex Magnetic Bead Panel 96?well Plate（美國Luminex公司）；磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，RIPA，BSA蛋白標準品等（羅氏和碧云天公司）。

1.3 實驗方法從液氮中取出凍存的標本，用組織研磨儀研磨，RIPA細胞裂解液冰上裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度。嚴格按照Multi?Pathway 9?plex Magnetic Bead Panel 96?well Plate說明書進行操作，制備10 000 pg/mL標準品、高濃度和低濃度質控品及9種細胞因子混合磁珠，并將標準品稀釋5倍制定標準曲線，蛋白標本于室溫融化混勻，離心（13 000 r/min、4℃、10 min、離心半徑6 cm）后取上清。將25 μL標準品、質控品及待測樣本分別與25 μL預混磁珠和25 μL緩沖液混合，4℃搖床過夜。將反應體系置于磁板上60 s，清洗，加25 μL MILLIPLEX?MAP檢測抗體室溫下震蕩1 h，加25 μL顯色劑室溫下震蕩反應30 min。將反應體系置于磁板上60 s，清洗，加入150 μL鞘液并使用Luminex公司液相芯片分析系統進行9種因子定量分析。樣本均采用復孔，結果取平均值。

1.4 統計學方法采用SAS 9.1.3軟件進行統計學分析，蛋白表達量的統計描述采用均數±標準差（滿足正態分布）或中位數和四分位數間距（不滿足正態分布）表示，銀屑病組和對照組蛋白表達量的差異性分析采用兩獨立樣本t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，變量間的相關性分析采用Pearson相關（滿足雙變量正態分布）或Spearman秩相關（不滿足雙變量正態分布）；采用Origin軟件繪制箱式圖。

2 結果

2.1 JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表達量比較t檢驗和Wilcoxon秩和檢驗分析結果顯示，銀屑病組和對照組JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表達量差異有統計學意義，且均表現為銀屑病組的表達量高于對照組。見表1和圖1、2。

表1 蛋白表達量的差異性分析結果Tab.1 Analysis of protein expression levels

2.2 部分因子間的相關性分析結果Spearman秩相關分析結果顯示，STAT5與p38、ERK1/2、JNK、STAT3之間均呈正相關。見表2。

3 討論

圖1 對照組與銀屑病組p38、ERK1/2、JNK MAPK的蛋白表達Fig.1 Compare the p38，ERK1/2，JNK MAPK between PV patients and controls

圖2 對照組與銀屑病組SATA3、STAT5的蛋白表達Fig.2 Compare the SATA3，STAT5 between PV patients and controls

表2 部分因子間的相關性分析結果Tab.2 Correlation analysis between some factors

本實驗的研究目的是定量分析9種因子在尋常型銀屑病中的蛋白表達情況，為以后更深入的研究提供更準確的參考。已有研究發現9種因子在銀屑病中均有一定的相互作用，如ZHENG等[7]發現在銀屑病皮損中，p38表達明顯增高，并促進炎癥反應；銀屑病發病的重要炎癥因子：腫瘤壞死因子?α（TNF?α）和IL?1可激活NF?кB和MAPK通路，誘導細胞增殖[8]；IL?22通過STAT3和ERK1/2途徑誘導角蛋白17（銀屑病相關性細胞角蛋白）表達，導致銀屑病炎癥反應和角質細胞異常增生等病理改變[9]；銀屑病角質細胞中JNK受CREB調節表達增高[10]，參與炎癥反應，誘導TNF?α、IL?17、IL?6表達[11]，這些炎癥因子也可被 p38通路調控[12-13]。因此，在銀屑病中這些因子共同作用，使角質形成細胞異常增殖和凋亡，出現炎癥因子異常表達。

從蛋白定量看到銀屑病皮損處JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表達均較正常皮膚增高，在銀屑病皮損中含量較高且變化最大的是p38，提示p38在銀屑病發病進程中發揮較為重要的作用。

很多銀屑病一線用藥也發現與這些因子相關，尤其是p38 MAPK。研究表明阿達木單抗可以抑制p38 MAPK和ERK1/2，可能是阿達木單抗治療銀屑病作用的機制之一[14]；這與復方甘草酸苷治療銀屑病的機制有相似之處，通過抑制p38 MAPK和ERK1/2及NF?кB來治療銀屑病皮損的炎癥反應[15]；阿維A可能通過降低STAT1和STAT3依賴機制的表達抑制銀屑病角質形成細胞的增殖[16]；芍藥甙能明顯抑制銀屑病JNK和p38 MAPK的表達[17]等等，為治療銀屑病提供一個更好的研究方向。

本研究首次發現STAT5在銀屑病皮損中表達增高，STAT3與STAT5同屬信號傳導及轉錄激活因子，在細胞內（T淋巴細胞、自然殺傷細胞等[18-19]）作用機制非常廣泛，可相互調節，但兩者有時介導不同甚至相反的生物效應。例如IL?6介導激活STAT3與STAT5，驅動Th9細胞的活化[20]，產生的IL?9能增加銀屑病患者皮膚損傷[21]。但也有研究表明，STAT5與STAT3有部分共同的基因位點，STAT5可抑制STAT3表達，從而抑制Th17細胞分化[22]（Th17細胞已知在銀屑病中發揮重要作用，其主要產生IL?17促進銀屑病炎癥反應[23]）。本實驗結果表明STAT3與STAT5的表達呈正相關性（P=0.003 2），表明兩者之間具有協同作用，或者協同作用大于拮抗作用，且與p38、ERK1/2、JNK表達正相關，推測在銀屑病中MAPK信號通路也可能影響STAT5和STAT3途徑而發揮炎性作用。

另外本研究發現p38與JNK、NF?кB、ERK1/2，ERK1/2與CREB、STAT3，Akt與p70S6K，STAT5與p38、ERK1/2、JNK、STAT3之間均呈正相關（P＜0.05），也系統地表明了9種因子相互作用，可能共同參與銀屑病發病機制，符合銀屑病多因子共同參與的發病機制，但其具體機制仍需要進一步研究探索。