Leptin促進腫瘤相關成纖維細胞活化及卵巢癌腹腔播散

章凡 楊宗元

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科（武漢430030）

卵巢癌惡性程度高，一旦發現大部分患者處于疾病的中晚期并出現典型的廣泛腹腔轉移及大量惡性腹水[1]。腫瘤微環境在腫瘤發生發展過程中的重要作用越來越被重視。惡性腹水作為卵巢癌患者特異性的腫瘤微環境，其產生與嚴重程度與疾病預后密切相關[2]；腫瘤微環境中的主要間質細胞成分是腫瘤相關成纖維細胞，其在腫瘤發生、耐藥、侵襲與轉移過程中起到關鍵作用[3]。而在腹水微環境中，腫瘤細胞以懸浮形式單個或以球體形式存在，抵抗失巢凋亡壓力進而介導腹腔黏附與侵襲過程[4]。腹水中除了大量細胞因子，化學因子之外，還包括大量免疫細胞、成纖維細胞及系膜細胞等。腹腔中的巨噬細胞能夠促進卵巢癌球體腫瘤細胞生存及腹腔播散侵襲過程[5]。相比而言，惡性腹水中的成纖維細胞的活性狀態及其對卵巢癌細胞黏附侵襲的影響鮮有報道。

瘦素（Leptin）本來作為一個人體能量代謝相關的基因，而如今被報道大量存在于卵巢癌患者惡性腹水中[6]，且其表達水平與卵巢癌患者預后負相關[7]。在以往研究中，Leptin被認為能夠誘導卵巢腫瘤細胞發生上皮間質轉化，維持腫瘤細胞干細胞屬性進而促進腫瘤侵襲[8-9]。在筆者之前的研究中，Leptin被證明通過調控Pi3k/AKT/MTOR通路活化促進卵巢癌細胞侵襲播散，中和腹腔中Leptin能夠遏制卵巢癌腹腔播散過程[10]。而Leptin是否通過調控微環境其他類型細胞活化進而間接影響卵巢癌腹腔播散尚無研究。本研究旨在探究Leptin對腹腔微環境中成纖維細胞活性作用，及其對腫瘤細胞惡性行為的影響。同時探索早期靶向腹腔Leptin對腹腔中活化腫瘤相關成纖維細胞含量及活性的改變，以及對卵巢癌腹腔播散結局的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養卵巢癌細胞系SKOV3和OV90購自美國標準生物品收藏中心（ATCC），成纖維細胞系MRC5購自中科院細胞庫，人系膜細胞系HMrSV5購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，正常卵巢成纖維細胞NOF來源于同濟醫院腫瘤生物醫學中心之前原代培養。腫瘤細胞用McCoy′s 5A培養基（Thermo Scientific），HMrSV5細胞及成纖維細胞用DMEM/F?12培養基添加10%胎牛血清，青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL，在37℃，5%CO2條件下傳代培養。

1.2 主要試劑與材料McCoy′s 5A及DMEM/F?12培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司。重組人Leptin蛋白購于Peprotech公司。IgG及Leptin中和抗體購自R&D公司。α?SMA鼠單抗，PDGFRB兔單抗，FAP兔單抗及GAPDH兔單抗購自美國Ab?cam公司。DAPI，羊抗兔，羊抗鼠熒光二抗購于武漢三鷹公司。增強化學發光（ECL）底物為美國Pierce公司產品。鼠尾膠原，Matrigel購于BD公司。

1.3 流式分選惡性腹水中腫瘤相關成纖維細胞取高級別漿液性卵巢癌初治患者腹水1 000 mL，在無菌條件下常溫離心1 000 r/min×10 min，棄上清后室溫下裂解紅細胞5 min，PBS洗凈后離心1 000 r/min×5 min，0.5%胰酶消化5 min后用200目濾網過濾后再標記兔抗PDGFRB抗體（1∶50），4℃孵育0.5 h，再用預冷PBS洗2遍后標記FITC標記羊抗兔（1∶100），再用預冷PBS洗2遍后用0.5 mL PBS重懸，用流式分選細胞儀分離FITC+細胞。

1.4 免疫熒光流式分選得到的PDGFRB+腫瘤相關成纖維細胞，或MRC5細胞以及原代NOF細胞（對照組及Leptin處理組），用4%多聚甲醛固定10 min，再用預冷PBS洗2遍，接著用0.1%TritonX?100破膜處理10 min，然后用5%BSA室溫封閉30 min，同時加鼠抗aSMA抗體（1∶100），37℃孵育2 h。PBS沖洗，同時加Cy3標記羊抗鼠（1∶200），37℃避光孵育1 h。之后均避光操作，PBS沖洗，DAPI工作液染核5 min，PBS沖洗后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 Transwell試驗Transwell上室每孔加入60 μL用無血清培養基1∶5稀釋的Matrigel，37℃放置2 h備用。凝固后各組小室上室內加入100 μL含2×104SKOV3或OV90細胞的無血清培養基，下室加入500 μL無血清培養基（對照組）或無血清培養基加1×104腹水成纖維細胞（實驗組），至培養箱培養48 h。后取出小室，用棉簽拭去膜上層細胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，1%結晶紫染色10 min，PBS洗凈后風干。高倍鏡下計數穿到膜背面細胞數，選5個不同視野計數。

1.6 系膜細胞撕開試驗CMAC標記的系膜細胞HMrSV5種于六孔板，用無血清培養基加5%BSA，直到細胞密度達到100%；計數SKOV3或OV90細胞各105個加入系膜細胞培養孔，實驗組加入經成纖維細胞共培養48 h后腫瘤細胞，48 h后鏡下比較腫瘤細胞球體撕裂系膜細胞面積大小。用Image J軟件定量撕裂面積大小。

1.7 ELISA16例惡性腹水來自武漢同濟醫院婦產科2017年1-4月診斷為卵巢癌的患者，為卵巢癌初治且未接受化療；同時取此期間12例卵巢良性病變如子宮內膜異位癥或卵巢黏液性囊腺瘤患者腹腔沖洗液作為良性對照；良惡性腹水獲得后在無菌條件下常溫離心3 000 r/min×10 min，取上清存儲于-80℃冰箱；ELISA操作步驟按照R&D公司提供的操作指南具體操作。

1.8 公共數據庫分析腫瘤微環境中4種主要細胞成分（腫瘤細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞及淋巴細胞）Leptin受體LEPR表達值從GEO公共數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中的GSE39396獲得，mRNA表達數據通過GCBI數據分析平臺（https：//www.gcbi.com.cn）進行標準化，均一化后進行表達水平比較。

1.9 Western blot試驗對照組及20 μg/mL Leptin處理72 h的MRC5細胞以及原代NOF細胞，胰酶消化，PBS充分洗滌。RiPA蛋白裂解液提取細胞蛋白，40 μg/孔上樣進行SDS-PAGE電泳，低溫濕轉至PVDF膜，5%BSA封閉40 min，一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加HRP標記二抗（1∶3 000），室溫孵育30 min，PBS充分洗掉背景后用增強ECL底物曝光。

1.10 膠原回縮試驗對照組及20 μg/mL Leptin處理72 h的MRC5細胞以及原代NOF細胞計數6× 105個混入100 μL膠原蛋白懸液（含68.75 μL DMEM/F-12培養基，0.72 μL NaOH（1 mol/L），31.25 μL鼠尾膠原），加入低黏附24孔板中。放置0 h和12 h后在顯微鏡下分別拍照，膠原面積用Image J軟件定量，回縮能力描述為占原始面積的百分數，每個樣本均有3個復孔。

1.11 動物試驗計數1×106卵巢癌細胞SKOV3接種于NOD?SCID免疫缺陷小鼠卵巢包膜，隨機分為IgG對照組及Leptin中和抗體處理組（每組12只老鼠）。接種后第1天開始每天1次腹腔給10 mg/kg IgG（對照組）或20 mg/kg Leptin中和抗體（處理組）持續1周；接種后第3天取兩組小鼠腹腔沖洗液，分離細胞成分后標記兔抗PDGFRB抗體（1∶50），4℃孵育0.5 h，再用預冷PBS洗2遍后標記FITC標記羊抗兔（1∶100），流式細胞學檢測比較兩組PDGFRB+細胞含量差異；接種后第7天取兩組小鼠大網膜組織石蠟包埋后，行H&E切片染色顯微鏡下觀察比較微轉移灶形成情況；接種后第30天，將各組老鼠麻醉后處死終止實驗比較腹腔腫瘤播散情況。所有動物相關操作符合動物試驗倫理規范。

1.12 統計學方法每次試驗至少重復3次，實驗所得計量數據用形式表示，組間差異比較采用非配對student′st檢驗，應用GraphPad Prism 6.0統計軟件。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌惡性腹水中成纖維細胞促進腫瘤細胞惡性行為高級別漿液性卵巢癌患者腹水中腫瘤細胞大多以球體形式存在，流式分選得到了PDG?FRB+的腫瘤相關成纖維細胞成典型的長梭形，這些細胞特異性的表達腫瘤相關成纖維細胞標志蛋白aSMA（圖1A）。這些腹水來源的腫瘤相關成纖維細胞作為驅化細胞能顯著增加卵巢癌細胞SKOV3和OV90的體外侵襲能力（圖1B）；同時在系膜撕開試驗中，發現腹水來源成纖維細胞不但能顯著增加腫瘤球體大小，也能顯著增加卵巢癌細胞SKOV3和OV90的系膜撕開能力（圖1C）。這些結果表明如同腫瘤原位轉移病灶一樣，卵巢癌患者惡性腹水中也大量存在腫瘤相關成纖維細胞，這些腫瘤間質細胞能夠顯著增加卵巢癌細胞的侵襲轉移能力。

圖1 卵巢癌患者腹水中腫瘤相關成纖維細胞促進卵巢癌細胞侵襲能力Fig.1 Malignant ascites?derived CAFs facilitates ovarian cancer cell metastasis

2.2 細胞因子Leptin在惡性腹水中大量表達ELISA檢測了12例良性卵巢腫瘤和16例惡性卵巢癌腹水中Leptin的表達水平差異，良性病變中Leptin表達水平為（132.1±15.6）pg/mL，惡性腹水中為（576.4±60.4）pg/mL，兩者具有顯著的表達差異（P＜0.001，圖2A）。因為Leptin主要通過結合其受體LEPR而發揮作用，在結腸癌顯微切割芯片表達譜數據中比較了LEPR在微環境中幾種主要成分細胞表達差異，發現相比腫瘤上皮細胞和血管內皮細胞，間質成纖維細胞表達更高的LEPR（圖2B）。這些結果表明Leptin在卵巢癌惡性腹水中特異性高表達，很有可能作用于間質成纖維細胞并調控起活化進而促進卵巢癌腹腔播散。

2.3 Leptin促進間質成纖維細胞活化成纖維細胞的持續性活化是腫瘤間質促進腫瘤侵襲轉移的關鍵因素。在成纖維細胞細胞系MRC5和原代分離卵巢成纖維細胞NOF中，外源性Leptin細胞因子能夠促進陳纖維細胞的骨架伸展，顯著增加細胞面積（圖3A）；同時，Leptin添加能夠顯著增加腫瘤相關成纖維細胞標志蛋白如α?SMA、FAP及PDGFRB在MRC5和NOF中的表達（圖3B）。在膠回縮試驗中，與對照組相比，Leptin能顯著增加MRC5和NOF細胞回縮重塑細胞外基質的能力（圖3C）。這些試驗表明Leptin能夠調控成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞方向轉化，也表明Leptin可能作為一個潛在的之類卵巢癌腹腔播散種植的治療靶點。

圖2 卵巢腫瘤良惡性腹水中Leptin及腫瘤微環境中各種細胞成分Leptin受體的表達情況Fig.2 Leptin expression in benign/malignant ascites and Leptin receptor expression in variant cell types of tumor microenvironment

圖3 Leptin促進成纖維細胞活化Fig.3 Leptin promotes malignant transformation of stromal firboblasts

2.4 早期腹腔應用Leptin中和抗體對卵巢癌腹腔播散的影響為觀察腹腔中Leptin對間質成纖維細胞的活化及對卵巢癌腹腔種植播散的影響，建立了卵巢癌原位種植模型，SKOV3細胞原位注射后，處理組開始腹腔每天給Leptin中和抗體持續1周，然后在不同時間段監測腫瘤進展情況（圖4A）。接種后第3天，在對照組和實驗組中取腹腔沖洗液流式檢測腫瘤相關成纖維細胞含量。結果表明，Leptin處理組PDGFRB+活化成纖維細胞含量顯著低于IgG對照組（圖4B）。接種后第7天，在IgG對照組和Leptin封閉抗體實驗組中取大網膜和腸系膜組織檢測微小轉移灶大小。結果表明，Leptin處理組微小轉移結節數量和大小顯著低于IgG對照組（圖4C）。接種后第30天，在IgG對照組和Leptin封閉抗體實驗組中白光下觀察卵巢腫瘤細胞腹腔播散情況。結果表明，Leptin處理組腹腔轉移結節數量和大小顯著低于IgG對照組（圖4D）。這些結果表明卵巢癌患者惡性腹水中Leptin參與了調控腫瘤相關成纖維細胞活化及腫瘤細胞種植過程，為卵巢癌的腹腔侵襲轉移過程提供了良好的微環境。

3 討論

卵巢癌主要的轉移途徑是播散種植，即腫瘤細胞從原位剝脫，在腹腔中被不斷改造獲得生存潛能到達遠處定值并形成新的病灶的過程。剝脫的腹水腫瘤細胞在腹腔脫離細胞外基質的狀態下，通過聚集抱團形成多細胞球體放大生存信號。同時，腫瘤發生發展過程中腫瘤微環境被活化，大量細胞因子和活化間質細胞協調腫瘤侵襲過程。在腫瘤原位轉移實體病灶中，成纖維細胞被腫瘤細胞釋放的TGFβ1活化為腫瘤相關成纖維細胞，后者繼而釋放大量細胞因子促進腫瘤細胞惡性進程[11]。腹水作為卵巢癌侵襲播散的重要階段，其中成纖維細胞的活化狀態，以及其對腹水腫瘤細胞的調控對腫瘤細胞侵襲至關重要。本文旨在研究腹水中腫瘤相關成纖維細胞的活性調節及其對卵巢癌腹腔播散種植的影響。

的確，如同在腫瘤原位轉移病灶中一樣，腹水中大量存在活化的腫瘤相關成纖維細胞。這些腹水來源的腫瘤相關成纖維細胞能夠促進卵巢癌細胞侵襲及系膜撕開能力，從而加速腹腔侵襲過程。腹水中這些腫瘤相關成纖維細胞可能來自原位剝脫而來，或惡性轉化的系膜細胞，血管內皮細胞以及骨髓來源的間充質干細胞[12]。這表明腹水微環境中，除了細胞因子成分，間質成纖維細胞也促進了卵巢癌的腹腔播散過程。

實驗結果表明Leptin在惡性腹水中特意性高表達，且Leptin受體在成纖維細胞表面高表達，提示Leptin很可能影響調控成纖維細胞的活化過程。的確，Leptin能夠促進成纖維細胞細胞系MRC5及正常卵巢成纖維細胞NOF表達腫瘤相關成纖維細胞特異標志蛋白，促進其回縮基質能力。鑒于腫瘤相關成纖維細胞在腫瘤進展中的關鍵作用和Leptin的潛在調控間質細胞活化作用，筆者在卵巢癌原位種植模型中觀察到早期腹腔中和Leptin能夠顯著抑制腹腔活化成纖維細胞數量及腹腔播散種植結局。以往關于Leptin在卵巢癌發生發展過程中的作用大多從肥胖女性卵巢癌發生易感性的角度探討其對卵巢癌發生發展過程中作用，或從Leptin作為細胞因子活化腫瘤生存通路惡性轉化卵巢腫瘤細胞角度探討其對卵巢癌進展的影響[13-14]；本研究關于Leptin調控成纖維細胞活性的發現彌補了之前Leptin調控腫瘤細胞上皮間質轉化的作用，表明其具備調控上皮及間質細胞活化的雙重作用。在今后的研究中，還需要進一步對Leptin調控成纖維細胞活化進行機制研究及其對微環境中其他成分如腫瘤相關巨噬細胞活化的調控作用。

總之，本研究在卵巢癌惡性腹水中發現大量腫瘤相關成纖維細胞，促進了腫瘤細胞的侵襲和系膜撕開能力；同時腹水中Leptin參與維持成纖維細胞的持續性活化，早期干預Leptin有望成為遏制卵巢癌腹腔播散的靶點。然而還需要進一步探究靶向Leptin對機體正常細胞組織的影響，確定其作為靶向治療的可行性和安全性，希望靶向腹水成纖維細胞活化或Leptin成為改善卵巢癌腹腔播散結局的有效手段。