密閉式體外培養系統對胚胎發育及小鼠學習和記憶能力的影響

顏曉紅，李友筑，周衛東，林莉，吳榮鋒，陶萍，余裕爐

(廈門大學附屬第一醫院生殖醫學中心，廈門 361003)

胚胎體外培養是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的關鍵技術，為了減少開放式培養體系中CO2培養箱內及室外環境劇烈變化對胚胎造成傷害，增加CO2培養箱數目、安裝復合式玻璃小門以減小開門次數和面積以保持胚胎培養環境的穩定性是目前可行的主要措施，但其代價十分昂貴，且可靠性也有待商榷[1-2]。近年來，因大氣污染導致人類生育功能下降的報道時有發生[3]。1988年Ranoux等[4]首次將人類卵子與精子密封于塑料冷凍管中，置受試者的陰道內培養48～52 h，將發育到4-細胞期的胚胎植入子宮后獲得了正常妊娠和分娩，但仍與空氣相接觸，其效果與常規開放式培養相同。本研究通過在小鼠胚胎中進一步探索密閉培養系統的可靠性，試圖建立新的胚胎體外培養體系。

材料與方法

一、研究對象

實驗所用SPF級昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。雄鼠4只，8周齡，體重大于25 g；雌鼠16只，8周齡，體重大于20 g。小鼠在室溫22～25℃、濕度40%～60%、光照交替(14 h光照、10 h黑暗)的SPF條件下喂養。實驗前4 d，雌性昆明小鼠腹腔注射10 U的孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后腹腔注射10 U人絨毛膜促性腺激素(HCG)。將注射了HCG的雌鼠與雄性昆明小鼠進行交配，交配成功以陰道栓的有無來判斷。

二、主要試劑和儀器

1.主要試劑：PMSG、HCG均購自寧波激素制品廠；配子處理、胚胎操作以及胚胎培養等相關試劑均為瑞典Vitrolife公司產品。

2.主要儀器：解剖顯微鏡、倒置顯微鏡和相差顯微鏡(Olympus，美國)；CO2培養箱、離心機和超低溫冰箱(Thermo，美國)；臺式高壓鍋(山東新華醫療)，電熱恒溫水浴箱(為上海精宏實驗設備)，DT-200小鼠跳臺測試箱、水迷宮(成都泰盟科技)。密閉培養設備為本院自己設計制造并獲國家發明專利(專利號：ZL 2016 1 0707688.6)。

三、小鼠卵母細胞的收集與胚胎體外培養

頸椎脫臼法處死超排卵母鼠，取出卵巢、輸卵管和子宮，在實體解剖鏡下，用眼科鑷子撕開輸卵管傘，用安裝有4號針頭(已斷尖)的注射器抽取1～2 ml已預溫的G-MOPS液沖洗輸卵管與子宮，收集各發育階段的卵與胚胎。為了觀察所取卵母細胞情況，用0.1%透明質酸酶去除卵母細胞周圍的卵丘細胞后，直接在實體解剖鏡或倒置顯微鏡下計數和觀察；為了觀察卵母細胞的受精和發育情況，則采用0.1%透明質酸酶去除其周圍的卵丘細胞后，經G-IVF-plus洗3次，移入G-1-plus培養滴中(20～30枚/50 μl)，覆蓋礦物油，在37℃、5% CO2、飽和濕度的條件下，置CO2箱中培養12～24 h；2-細胞胚胎自輸卵管或子宮沖出后，在倒置顯微鏡下觀察與記錄，以備小鼠胚胎移植與著床點觀察。

四、胚胎密閉培養

本研究所用密閉培養設備如圖1所示。將該裝置預先放入Thermo 3111培養箱中(37℃、6% CO2、飽和濕度)并旋開蓋子于通氣狀態(圖1A、1C)下備用。胚胎培養采用3001培養皿制備微滴進行培養，方法同常規培養。將培養皿放入密閉培養裝置中(圖1B、1D)，蓋上蓋子但不密封，使設備處于通氣狀態，在培養箱中平衡30 min，隨后蓋緊蓋子使設備處于密封狀態置于培養箱中培養36 h，然后換囊胚培養液繼續密閉培養24 h。

A.密閉培養設備外觀圖；B.內部結構圖；C.通氣孔；D.密封圈圖1 胚胎密閉式培養設備圖

常規培養組(對照組)中，胚胎采用常規方法培養，培養皿置于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下的CO2箱中培養；囊胚培養時放入低氧的三氣培養箱中培養。

本研究中，根據G系列培養液說明書要求的時間進行換液。兩組研究中，卵裂胚采用G1-plus培養液進行培養，囊胚采用G2-plus培養液進行培養。

五、小鼠胚胎移植與著床點觀察

1.小鼠胚胎移植：收集小鼠2-細胞胚胎，分成密閉培養組和對照組，分別體外培養至囊胚期以供移植。采用子宮內移植的手術方法進行移植，受體鼠每側子宮移植7～8個胚胎，操作后在解剖顯微鏡下檢查移植管中有無余留胚胎。移植結束，復位縫合。為確定移入胚胎的分布，在移入后的第10天打開腹腔檢查移植胚胎的植入情況。

2.小鼠胚胎著床點觀察：根據小鼠胚胎發育時程，在所需胚胎著床的時間尾靜脈注射0.4%臺盼藍，其后頸椎脫臼處死小鼠，從腹部打開，取出完整的卵巢和子宮，進行拍照。

六、Morris水迷宮實驗

水迷宮主要由一圓柱型水池和一可移動位置的站臺組成。水池高70 cm，直徑80 cm，站臺直徑8 cm，水池上空通過一個數字攝相機與計算機相連接。預先在水池中注入清水，水深15 cm，加入炭素墨水使池水變為不透明的黑色，站臺表面為黑色，使小鼠不能看到，水面高出站臺表面0.5 cm。水溫控制在(22±0.5)℃，在水池上標定相同一點作為每次實驗小鼠的入水點。站臺置于離入水點較遠的象限中間，實驗過程保持站臺位置不變。每次實驗以120 s為限，紀錄動物從入水點到達站臺所需時間以及在這段時間內的游泳路程和速度，以所需時間作為學習和記憶成績，若設定時間內未找到站臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為120 s。每次實驗在隔音的房間內進行，水池、光源、鼠籠等實驗室各物件的位置保持不變。經3 d訓練，若小鼠在120 s內找到站臺，讓其在站臺上停留20 s，若小鼠未找到站臺，將其放在站臺上使其停留20 s。于第4天、第5天、第7天和第11天進行4個階段的Morris水迷宮學習和測試。

七、小鼠跳臺實驗

打開DT-200小鼠跳臺測試箱，將參加實驗的各組小鼠先放入反應箱銅柵處自由活動3 min，熟悉實驗環境。然后通以32 V交流電，設置實驗時間為5 min，小鼠受到電擊后將尋找跳臺以躲避電擊。實驗時將實驗鼠直接放上跳臺，記錄各組小鼠第一次跳下平臺的時間(潛伏期)和10 min內從跳臺跳下的錯誤次數(記作錯誤次數)。測驗時若小鼠停留在平臺的時間超過10 min，其潛伏期以10 min計。連續訓練4 d，每天1次。每次進行跳臺實驗時，要求試驗環境，各種參照物保持一致，而且保持安靜、空氣清新及水溫恒定。

八、統計學分析

本研究相關數據采用SPSS 16.0軟件進行分析。統計數據以(±s)表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、密閉培養對昆明小鼠胚胎發育與著床的影響

收集小鼠2-細胞胚胎，分成密閉培養組和對照組，分別體外培養至囊胚期以供移植。受體鼠每側子宮7～8個胚胎，胚胎移植后第10天解剖檢查胚胎植入情況。研究結果顯示，在密閉培養組(n=8)中共有6只小鼠受孕，受孕率為75%，對照組(n=7)中共有5只小鼠受孕，受孕率為71.43%，兩組間無顯著差異(P>0.05)；對于囊胚植入情況，在密閉培養組中移植120個囊胚，囊胚植入率為59.17%，對照組中移植105個胚胎，囊胚植入率為57.14%，兩組間無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組培養方式對小鼠胚胎發育和著床的影響

另外，我們根據小鼠胚胎發育時程，在所需胚胎定位的時間尾靜脈注射臺盼藍，觀察移植胚胎著床數和著床點。結果顯示，密閉培養組胚胎著床數與對照組無統計學差異(P>0.05)(圖2)。以上結果提示，密閉培養體系中小鼠胚胎具有良好的發育潛能，該體系能夠支持小鼠早期胚胎在密閉培養條件下正常發育。

二、密閉培養的胚胎移植后對新生小鼠學習與記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗是學習與記憶研究的經典實驗。本研究采用Morris水迷宮實驗研究密閉培養胚胎移植后對新生小鼠學習與記憶能力的影響，結果顯示，密閉培養組第1～4階段水迷宮定位航行時間較對照組均無顯著差異(P>0.05)(表2)。跳臺實驗也是檢測動物學習與記憶能力的常用方法。本研究采用小鼠跳臺實驗研究密閉培養胚胎移植后對新生小鼠學習與記憶能力的影響，結果顯示與對照組相比，密閉培養組的潛伏期與錯誤次數均無顯著差異(P>0.05)(表3)。以上結果提示，密閉培養的胚胎移植后對新生小鼠學習能力沒有顯著影響。

A：對照組(左：陰性對照組；右：移植組)，B：密閉培養組(左：陰性對照組；右：移植組)圖2 小鼠胚胎移植著床點

組 別只數定位航行用時(s)第4天第5天第7天第11天對照組 2017.224±7.83116.534±8.23615.853±9.20113.936±7.279密閉培養組2018.673±5.83416.908±4.28415.936±5.38317.538±9.627

表3 新生小鼠跳臺實驗結果(x-±s)

討 論

在輔助生殖技術中，早期胚胎體外培養是IVF-ET的關鍵環節[5]。近年來，隨著早期胚胎體外培養體系的不斷改進與完善，研究者們逐漸將目光集中在早期胚胎體外發育的培養環境上[6]。由于近年來大氣環境的污染，導致人類生育功能受到影響[3，7]。在IVF-ET中，早期胚胎培養過程中容易受到包括室內外氣體變化及波動的影響，因此室內外及培養箱中的氣體質量及穩定性對胚胎發育至關重要，如何有效降低氣體對胚胎發育的影響也成了人們關注的熱點[8-9]。密閉培養系統是一個與外界環境隔離的培養系統，其優點在于可有效避免外界環境波動對胚胎的影響[10]。本研究通過在小鼠胚胎中探索密閉培養系統的可靠性及其對胚胎發育潛能的影響。

本研究發現，在密閉胚胎培養體系中培養的小鼠胚胎具有較好的受孕率(75.00%)和囊胚植入率(59.17%)，與正常對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。這提示在密閉培養體系中小鼠胚胎具有良好的發育潛能。

Morris水迷宮實驗是1981年由英國心理學家Richard G Morris建立的，主要用于研究實驗動物的空間學習記憶能力[11-12]。此后，Morris水迷宮實驗被不斷地完善和改進，逐漸成為研究學習與記憶最常用的實驗方法之一，目前已被廣泛應用于和空間學習記憶相關的藥理學、毒理學、藥劑學、行為生物學等多個學科或領域的科學研究[13-14]。本研究采用Morris水迷宮實驗研究密閉培養體系的胚胎移植后對新生小鼠學習和記憶能力，結果顯示，密閉培養組第1～4天水迷宮定位航行時間較對照組均無顯著差異(P>0.05)，提示本密閉體系培養的胚胎移植后新生小鼠學習記憶能力沒有受到明顯影響。小鼠跳臺實驗也是一種常用的評價小鼠學習記憶能力的方法，能較客觀地反映動物經過一次刺激后記憶獲得的情況[15-16]。本研究通過小鼠跳臺實驗研究密閉培養胚胎移植后對新生小鼠學習和記憶能力的影響，結果顯示，與對照組相比，密閉培養組的潛伏期與錯誤次數均無顯著差異(P>0.05)。

綜上所述，密閉培養體系培養的胚胎與常規培養得到的胚胎相比，在胚胎質量和著床上并無明顯差異，且對其子代小鼠學習與記憶能力也沒有明顯影響，提示胚胎密閉培養體系方法操作簡單、結果安全可靠且成本較低，具有較大的發展潛力，值得進一步的深入研究。