原發性高血壓患者血清miRNA-663水平與RAAS生化標志物的相關性分析

劉文果，陳石磊，萬志佳，魏 星

(1.重慶市結核病防治所檢驗科 400050；2.陸軍軍醫大學軍事預防醫學院防原醫學教研室，重慶 400038；3.重慶市沙坪壩區婦幼保健計劃生育服務中心檢驗科 400030；4.重慶市奉節縣人民醫院檢驗科 404600)

原發性高血壓是以血壓升高為主要臨床表現的綜合征，是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險因素。原發性高血壓會嚴重影響心、腦、腎等重要臟器的結構與功能，最終導致這些器官的功能衰竭，迄今其仍是心血管疾病死亡的主要原因之一[1-2]。原發性高血壓的發病機制十分復雜且不明確，目前研究表明原發性高血壓是多因素、多層次共同作用的結果。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)在高血壓病的發生、發展中發揮極其重要的作用[3-4]，腎素是RAAS調控血壓的始動因子，是RAAS級聯反應中的限速環節[5]。最近研究表明，miRNA在原發性高血壓的發病機制中可能發揮了重要作用[6-7]。相關研究發現miRNA-663表達降低可引起腎素mRNA水平升高[8-10]，但原發性高血壓患者miRNA-663的表達及其與RAAS生化標志物的相關性研究較少見報道。本研究觀察了原發性高血壓患者外周血血清miRNA-663表達水平及其與RAAS生化標志物的相關性，為原發性高血壓的診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 原發性高血壓組：2016年3月至2017年3月在奉節縣人民醫院門診和住院的原發性高血壓患者50例，均符合世界衛生組織及國際高血壓協會對原發性高血壓的診斷標準：Ⅰ級高血壓為140～159/90～99 mm Hg，Ⅱ級高血壓為160～179/100～109 mm Hg。其中男30例，女20例；年齡45～71歲，平均(58.4±6.8)歲；Ⅰ級高血壓29例，Ⅱ級高血壓21例。排除合并腎臟疾病、糖尿病和嚴重心腦血管疾病的患者。健康對照組：健康者50例，其中男30例，女20例；年齡45～70歲，平均(57.5±7.2)歲。兩組的年齡、性別差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液標本處理 血液標本均在采集后立即處理：4 ℃ 2 000 r/min，離心10 min，收集血清，-80 ℃保存備用。

1.2.2血清miRNA-663測定

1.2.2.1miRNA的提取和純化 采用mirVana PARIS Kit(Ambion公司，美國)試劑盒提取和純化miRNA，取血清樣品500 μL，室溫下加入等體積變性液，立即充分混勻后加入等體積酸性酚氯仿，渦旋震蕩30～60 s；室溫下14 000 r/min離心5 min。取上清液于新管中，加入1.25倍體積的無水乙醇，充分混勻后加入柱子中，12 000 r/min離心30 s，棄濾液；往柱子中加入700 μL洗液，12 000 r/min離心30 s，棄濾液；往柱子中加入500 μL洗液，12 000 r/min離心30 s，棄濾液；重復用500 μL洗液洗滌1次，棄濾液后12 000 r/min離心1 min；加入60 μL 95 ℃預熱的緩沖液到柱子中，12 000 r/min離心1 min，收集miRNA立即進行反轉錄。

1.2.2.2反轉錄 采用TaqMan⑩MicroRNA 反轉錄試劑盒將提取的miRNA反轉錄成cDNA，按說明書操作。miRNA-663反轉錄的反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；miRNA-663反轉錄引物序列：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GCG GTC CC-3′；上游引物序列：5′-ACA CTC CAG CTG GGA GAT G-3′；下游引物序列：5′-ACT ATG GTG TCG TGG AGT CG-3′。U6反轉錄的反應條件：37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；U6反轉錄引物序列：5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA ATA T-3′；上游引物序列：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游引物序列：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。

1.2.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 采用Maxima SYBR Green qPCR Kit(Thermo scientific，美國)試劑盒進行，按試劑盒說明書操作：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性20 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，重復40個循環，然后進行溶解曲線分析，結果采用比較閾值法計算，即目的基因的量=2-ΔΔct，ΔΔCT=(實驗組目的基因Ct值-實驗組管家基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組管家基因Ct值)。

1.2.3血清血管緊張素轉換酶(ACE)活性測定 取適量血清，根據試劑盒操作說明書用化學比色法檢測ACE活性，試劑盒購自Baomanbio公司(JK50235.2)。

1.2.4血清腎素(RA)、血管緊張素(Ang)Ⅱ、醛固酮(ALD)水平檢測 取適量血清，根據試劑盒操作說明書采用放射免疫法檢測血清RA、AngⅡ、ALD水平，試劑盒購自北京福瑞生物工程公司。

2 結 果

2.1兩組受試者外周血miRNA-663表達 本研究通過提取兩組受試者外周血miRNA，反轉錄后采用熒光實時定量PCR法檢測了外周血miRNA-663表達，發現原發性高血壓患者外周血miRNA-663表達相對于健康對照組顯著下調(P<0.01)，相對于健康對照組，原發性高血壓患者外周血miRNA-663表達下調了39.10%。見圖1。

圖1 兩組受試者血清miR-663表達水平比較

2.2兩組受試者外周血血清ACE活性及RA、Ang Ⅱ、ALD水平測定 分離兩組受試者外周血血清，分別采用化學比色法和放射免疫法檢測了外周血ACE活性及RA、Ang Ⅱ、ALD水平，發現原發性高血壓患者外周血血清ACE活性及RA、Ang Ⅱ、ALD水平相對于健康對照組均顯著上調(P<0.01)，原發性高血壓患者外周血血清ACE活性升高了53.29%，外周血血清RA、Ang Ⅱ、ALD水平分別升高了38.61%、72.39%、54.23%。見表1。

2.3原發性高血壓患者外周血血清miRNA-663水平與RAAS生化標志物的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，原發性高血壓患者外周血血清miRNA-663水平與外周血血清ACE活性及RA、AngⅡ、ALD均呈顯著負相關關系。見表2。

表1 兩組受試者外周血血清ACE活性及RA、AngⅡ、ALD水平比較

注：與健康對照組比較，*P<0.01

表2 原發性高血壓患者外周血血清miRNA-663水平與RAAS生化標志物的相關性分析

3 討 論

原發性高血壓是一種遺傳因素和環境因素相互作用所致的心血管疾病，其發病機制復雜。研究結果顯示，RAAS過度激活、交感神經活動亢進、血管內皮功能受損、自身免疫、炎性反應、氧化應激等均被證實參與了原發性高血壓的發生，其相應的血液循環生化標志物在原發性高血壓的發生、發展中發揮了重要作用[11-12]，在原發性高血壓的診療、預防等方面也發揮了重要的提示作用。RAAS與血管舒張、收縮及水鹽代謝關系密切，在高血壓形成、發展中起著關鍵作用；在RAAS各個環節中，腎素、ACE、AngⅡ、ALD等起到了重要作用[13-14]。腎素主要由腎小球旁器的球旁細胞所合成，催化血管緊張素原產生AngⅠ，AngⅠ在ACE催化下形成AngⅡ，AngⅡ能夠高效地收縮血管，增加ALD分泌，最終導致血壓升高。

miRNA是一類長約22個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，其可作用于相應靶基因mRNA，在細胞增殖與分化、細胞凋亡、神經發育等多種生命活動中發揮調控作用。現在研究發現多種miRNA表達異常可能參與了原發性高血壓的發生、發展[15-18]。在高血壓性腎病患者腎臟髓質miRNA-181a表達降低可以引起腎素mRNA水平升高。GOYAL等[19]發現小鼠胎兒大腦中miRNA-27a、miRNA-27L的升高可以降低ACE-1蛋白水平。ESKILDSEN等[20]發現miRNA-132在AngⅡ介導的高血壓大鼠心臟、大動脈及腎臟中高表達。

本研究通過對比研究發現，原發性高血壓患者血清miRNA-663表達顯著降低，同時發現原發性高血壓患者的RAAS系統生化標志物ACE活性及RA、AngⅡ、ALD表達升高；通過相關性研究發現，原發性高血壓患者血清miRNA-663水平與ACE活性及RA、AngⅡ、ALD水平呈顯著負相關關系，提示miRNA-663可能有抑制原發性高血壓患者RAAS系統活性升高的效應，miRNA-663可能在原發性高血壓發生、發展過程中發揮重要效應，其有望成為原發性高血壓診斷及區分嚴重程度的分子標志物，值得進一步研究探討。