唾液miRNA-205檢測在喉鱗狀細胞癌中的診斷價值

羅彬瑞，郭天虹，黃遠帥△

(西南醫科大學附屬醫院輸血科，四川瀘州 646000)

頭頸癌是全世界第六大常見腫瘤，其中喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，而喉鱗狀細胞癌(LSCC)是喉癌中最常見的組織學類型[1-2]。目前喉癌的治療方法主要包括外科手術切除、放療和化療，這些治療方法對早期喉癌患者效果較好，但對晚期患者的治療效果欠佳，因此，其5年生存率也不理想[3]。因此，發現喉癌的早期診斷標志物顯得尤為重要。微小核糖核酸(miRNA)參與了人體細胞多種重要的調節過程[4]，而miRNA的異常表達與腫瘤發生、發展的關系已成為目前研究的熱點。miRNA-205作為miRNA家族中重要的一員已被發現在許多類型的腫瘤中呈異常表達，包括前列腺癌、膀胱癌和頭頸部癌(口咽癌、鼻咽癌、喉癌等)等[5-7]。

目前，已有多項研究發現LSCC患者中有特別的miRNA表達譜(包括miRNA-205)[7-9]，并能提示LSCC的診斷，但這些研究都是基于患者的組織或血液標本(血清或血漿)。組織和血液標本都不是適合廣泛篩查的標本類型：首先腫瘤組織標本的收集是侵入性、有創性的操作，且腫瘤組織的出現說明患者已出現了癌變，不適用于廣泛人群的早期大規模的普查；其次，血液標本的收集繁瑣，且也屬于有創性操作，并有感染的風險，對于普查項目而言大眾接受度不高。因此，找到一種合適、方便易獲取、無創的標本類型作為篩查項目顯得尤為重要。目前有研究發現，miRNA存在于多種體液中[10]，包括血液、尿、乳汁、淚液、唾液等12種人體體液，其中唾液是所有體液中miRNA含量最為豐富的組織，且很多血液中的miRNA也同樣存在于唾液中。人體每天都要分泌大量唾液，唾液標本收集方便且為非侵入性，對于LSCC患者，唾液比血液更鄰近病變組織。因此，以唾液miRNA作為生物標志物對LSCC的診斷和預后判斷是非常值得探討的[11]。目前唾液miRNA在頭頸部鱗癌中的研究仍是熱點，其中口咽癌、食管癌等都有單獨的研究并發現有特征的唾液miRNA變化譜[12-13]，而單獨的miRNA在LSCC患者唾液中的表達水平以及其對早期LSCC的診斷價值如何，國內外鮮見報道。本研究初步探討唾液miRNA-205對LSCC早期診斷的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究的患者唾液取自本院初診的15例LSCC患者、10例喉聲帶息肉(VCP)患者及10例體檢中心的健康體檢者。LSCC患者均為男性，漢族，平均年齡(60.40±8.39)歲，納入LSCC組。所有LSCC、VCP患者入院后均經病理活檢(金標準)證實，且無伴發其他慢性病、傳染性疾病、口腔疾病，如糖尿病、結核、口腔潰瘍等。LSCC患者手術前均未接受放化療等治療。以年齡、性別(均為男性)、種族(均為漢族)匹配且無其他疾病的VCP患者、健康體檢者分別納入VCP組、健康對照組，每組10例。所有納入的研究個體均簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑 miRNA-205引物委托上海生工生物工程有限公司合成(F：5′-AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA -3′；外參引物包含在德國凱杰公司的miRNeasy Serum/Plasma試劑盒中)；提取試劑選擇德國凱杰公司的miRNeasy Serum/Plasma試劑盒(規格型號：217184)；外參是德國凱杰公司的miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control(cel-39)(規格型號：219610)；反轉錄為德國凱杰公司的miScriptⅡ RT試劑盒(規格型號：218161)；擴增選擇德國凱杰公司miScript SYBR Green PCR試劑盒(規格型號：218073)。PCR擴增儀選用ABI-7500熒光定量PCR儀；凝膠成像系統采用GBOX-CHemi-XR5(英國Syngene公司)。

1.3方法

1.3.1唾液采集 唾液收集前，所有研究個體需禁食、禁飲2 h以上。收集時使用50 mL無菌無酶離心管，采用非刺激性的收集方法使唾液自然流出，收集量需達3 mL。唾液收集完后，4 ℃、1 900 r/min離心10 min取上清液至1.5 mL EP管，再以4 ℃、16 000 r/min離心10 min后再棄沉淀取上清液，將所獲上清液至1.5 mL EP管置-80 ℃保存。標本收集好后需2 h內作出上述處理。LSCC患者手術前和手術后6個月各采集1次唾液標本；VCP患者術前采集1次唾液標本；健康體檢者采集1次唾液標本。

1.3.2臨床資料收集 收集LSCC患者的臨床資料，包括性別、年齡、個人史(吸煙、飲酒史)、腫瘤生長部位、分化程度、臨床病理分期。腫瘤臨床分期根據腫瘤的生長范圍及擴散程度,按2002年國際抗癌聯盟(UICC)喉癌TNM分期方案分為Ⅰ～Ⅳ期。

1.3.3RNA提取及反轉錄 按照試劑盒說明書提取RNA：取唾液上清液200 μL，加入1 mL QIAzol混勻孵育后,加入1 mL氯仿進行萃取,離心后,上清液經離心柱過柱,洗脫獲得miRNA。加入氯仿前加入3.5 μL德國凱杰公司的miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control(cel-39)作為外參。使用Nanodrop ND-1000檢測提取總RNA的質量,總RNA的A260/A280值在1.8～2.1為合格的RNA樣品(說明樣品RNA制備較純，無蛋白質污染)，可進行下一步操作。

取12 μL提取合格的RNA按照試劑盒說明進行反轉錄。反應體系組成：2 μL miScript Reverse Transcriptase Mix(一種經優化的poly(A)聚合酶和反轉錄酶混合物)、2 μL 10× miScript Nucleics Mix(包括dNTPs、rATP、oligo-dT引物等)、4 μL 5× miScript HiSpec Buffer、12 μL miRNA，然后進行反轉錄。反應條件為37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。反轉錄反應完成后cDNA用無酶水以1∶10稀釋后置-20 ℃保存。

1.3.4運用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測唾液中miRNA-205的相對表達量 反轉錄產物使用德國凱杰公司miScript SYBR Green PCR試劑盒聯合miRNA特異性前向引物進行RT-PCR檢測,以Cel-miRNA-39作為外參miRNA。反應體系組成:2.5 μL RT產物、2.5 μL特異前向引物、2.5 μL通用的反向引物、12.5 μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、5 μL無酶水。反應條件：95 ℃ 15 min后，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個循環。同時做溶解曲線判斷基因擴增的特異性。RT-PCR檢測在ABI-7500熒光定量PCR儀上完成,試驗結果使用2-ΔΔCt法對目的基因進行相對定量。

2 結 果

2.1各組唾液中miRNA-205的相對表達水平 采用RT-PCR定量檢測15例LSCC患者和10例VCP患者以及10例健康者唾液中的miRNA-205表達水平，發現與健康對照組(2.33±0.97)相比，LSCC組患者(11.73±4.53)及VCP組患者(9.72±5.12)唾液中miRNA-205的表達水平均上調,LSCC組患者上調更明顯，且差異有統計學意義(P=0.036)。10例VCP患者唾液中的miRNA-205的表達水平相比于健康對照組也呈上調趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 3組唾液中的miRNA-205表達水平

表1 LSCC患者唾液中miRNA-205的相對表達水平與臨床參數的相關性

注：吸煙指數(SI)=每日吸煙支數×吸煙年數；SI<200為輕度吸煙，200～400為中度吸煙，>400為重度吸煙；本研究中無中度吸煙者

2.2LSCC患者唾液中miRNA-205的相對表達水平與臨床參數的相關性 采用Mann WhitneyU檢驗分析發現，腫瘤中分化者較腫瘤高分化者唾液中miRNA-205的相對表達量高，Ⅲ～Ⅳ期的LSCC患者唾液中miRNA-205的相對表達量也高于Ⅰ～Ⅱ期的患者，但差異均無統計學意義(P=0.945、0.536)。其他臨床參數(患者年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤的生長部位)與miRNA-205的表達水平均無關。見表1。

2.3LSCC患者唾液中miRNA-205對LSCC的診斷價值 采用ROC曲線分析miRNA-205對LSCC的診斷價值發現，唾液中miRNA-205區分LSCC患者與健康者的曲線下面積(AUC)為0.753 0(95%CI:0.546 0～0.961 0，P=0.036)，截斷值取1.617 4時，靈敏度與特異度分別為86.7% 與70.0%。說明唾液中的miRNA-205檢測可作為LSCC診斷的生物標志物。見圖2。

圖2 ROC曲線

圖3 LSCC患者術前、術后唾液中的miRNA-205表達水平

2.4LSCC患者唾液中miRNA-205術前、術后的變化 為了評價LSCC患者唾液中miRNA-205術前、術后的動態變化，監測了5例LSCC患者手術前和手術后6個月的miRNA-205的變化，這5例患者手術后的miRNA-205相對表達水平(9.75±4.82)較手術前(12.53±6.83)有下降的趨勢，但差異無統計學意義(P=0.841)。研究再比較了手術后與健康對照組的miRNA-205的表達量發現，手術切除腫瘤組織后，miRNA-205的表達水平與健康對照組差異無統計學意義(P=0.440)。見圖3～4。

圖4 LSCC患者術后與健康對照者唾液中的miRNA-205表達水平

3 討 論

miRNA的發現為腫瘤的診斷、發生和發展機制，以及治療的研究開啟了新的方向。近年來，越來越多的研究發現miRNA在腫瘤中的表達量有異常改變，這使得miRNA可能成為腫瘤診斷的新的生物學標志和治療藥物作用的靶標。CAO等[7]應用miRNA芯片的方式篩選了6對LSCC及其鄰近正常組織中差異性表達的miRNA，發現了29個差異表達的miRNA(包括26種上調的和3種下調的miRNA)，如上調的miRNA-21、miRNA-93、miRNA-205，以及下調的miRNA-708、miRNA-125b、miRNA-145等。這些差異表達的miRNA可能在LSCC的發生和發展中起到關鍵作用，這也為進一步研究miRNA的功能提供了一個新的視角。AYAZ等[9]采用高通量實時定量聚合酶鏈反應篩選LSCC患者與健康對照者血漿中差異表達的miRNA，發現了17種上調的miRNA和9種下調的miRNA，其中有5種miRNA是從未在其他疾病中發現的，屬于LSCC特異性的miRNA(miRNA-603、miRNA-1303、miRNA-660-5p、miRNA-331-3p和miRNA-212-3p)。唾液作為血液循環的末端產物，與血液中的很多物質都有相同的表達譜，這使其成為很多疾病早期診斷和治療的特異性生物標志物[11-14]。

本研究以LSCC患者和VCP患者、健康者的唾液為出發點，檢測唾液中的miRNA-205的表達情況，探討其對LSCC早期診斷的臨床價值發現:LSCC患者的唾液中miRNA-205的表達水平相比健康者顯著上調,而與LSCC早期癥狀相似的VCP患者唾液中miRNA-205的表達水平相比健康者也有上調，但差異無統計學意義(P>0.05)。同時本研究采用了ROC曲線分析了唾液中miRNA-205的診斷效能，結果顯示其AUC為0.753 0，截斷值取1.617 4時，靈敏度與特異度分別為86.7%與70.0%，這說明了唾液中的miRNA-205檢測可作為LSCC診斷的生物標志物且診斷性能良好。同時，本研究中LSCC患者唾液中miRNA-205的顯著上調的變化趨勢與之前研究提示的腫瘤組織中的miRNA-205的變化趨勢一致[6]，這說明了唾液中的miRNA-205可能是腫瘤組織細胞的釋放，這與目前許多研究者認為的循環中核酸起源的假設一致[15]。但其真正的來源與機制還需要進一步的研究。

本研究還比較了5例LSCC患者手術前和手術后唾液中miRNA-205的動態變化，發現LSCC患者手術后唾液miRNA-205的水平有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。同時分析了一些基本臨床參數與miRNA-205表達水平的關系，雖然結果顯示腫瘤中分化者較腫瘤高分化者唾液中miRNA-205的相對表達量高，Ⅲ～Ⅳ期的LSCC患者唾液中miRNA-205的相對表達量也高于Ⅰ～Ⅱ期的患者，但差異均無統計學意義(P>0.05)。這可能與本研究所納入的研究樣本較少、組間差異大有關，其中的相關性尚需進一步深層次的研究。

綜上所述，本研究檢測了LSCC患者唾液中miRNA-205的表達水平，并發現唾液中miRNA-205存在高表達，可作為LSCC早期診斷的標志物。miRNA-205作為miRNA家族的成員，其在惡性腫瘤組織和細胞中的表達對指導腫瘤的早期診斷和及早干預、治療都有著重大的意義[6，16-17]。如果唾液中的miRNA-205能夠成為一種無創、可行性高、方便的檢測手段，將對miRNA的臨床應用有重大意義。本研究由于是初步的探討性研究，樣本數量較少，且可能由于地域差異，于本院就診的LSCC患者均為男性，因此結果存在一定的局限，所以更多樣本、不同的地域的研究將是下一步要做的工作。