多重DPO—PCR檢測轉基因玉米MON810和MIR604體系建立

周陸寧 張銳 麥晨 魏霜

摘要 針對轉基因玉米MON810和MIR604品系插入位點序列，分別設計品系特異性DPO引物，建立轉基因玉米MON810和MIR604品系檢測的多重DPO-PCR方法。結果表明，設計的DPO引物特異性強，靈敏度達0.5 ng/μL，并且對退火溫度不敏感。該檢測方法特異性強、靈敏度高，適合于對轉基因玉米MON810和MIR604品系進行快速檢測。

關鍵詞 轉基因玉米；MON810；MIR604；多重DPO-PCR

中圖分類號 S513 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）17-0001-02

Abstract Specific DPO primers based on the sequence of exogenous fragments of genetically modified maize MON810 and MIR604，a multiplex DPO-PCR method has been developed for the detection of genetically modified maize MON810 and MIR604 simultaneously. The specificity and sensitivity of the method have been tested，the results showed that the DPO primers were of high specificity，the sensitivity of the method was 0.5 ng/μL and insensitive to the annealing temperature. This method has strong specificity and high sensitivity，and is suitable for rapid detection of genetically modified maize MON810 and MIR604.

Key words genetically modified maize；MON810；MIR604；multiplex DPO-PCR

截至2016年，全球轉基因作物種植面積達1.851億hm2，同比增加3%[1]。隨著大量轉基因農產品的涌現，轉基因作物的安全性問題不容忽視。我國頒布了相關法律法規及條例，規定了轉基因標識制度及要求。

PCR是檢測轉基因的主要方法之一，但普通PCR檢測通量較低。多重PCR是在反應體系內加入多對引物，可同時檢測多個靶基因，在提高檢測通量的同時也降低了檢測成本。傳統多重PCR體系中，引物之間存在退火溫度、引物二聚體、錯配等差異，容易造成靈敏度下降、非特異性擴增等問題。

雙啟動寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一種新型PCR引物設計方法[2]。原理：引物的5′端序列由18～25個堿基組成，而3′端序列由6～12個堿基組成，2段引物用寡聚次黃嘌呤（inosine，I）進行連接，次黃嘌呤的退火溫度低，可以讓引物在退火時寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結構，從而使引物形成2個獨立的雙特異性引物結構。研究表明，DPO引物的5′端和3′端引物區域中任何一端有3個及以上堿基的錯配，PCR反應將不能進行，大大提升了引物的特異性。該技術為多重PCR提供了一種新的引物設計方式，并已經廣泛應用于病原菌檢測中[3-7]。因此，本研究旨在建立基于DPO引物的多重PCR方法，用于同時檢測轉基因玉米MON810和MIR604品系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品系：轉基因玉米MON810、轉基因玉米MIR604、轉基因玉米TC1507、轉基因玉米MON863、轉基因玉米BT1

76、轉基因玉米MON89034、轉基因大豆GTS40-3-2、轉基因油菜GT73、轉基因水稻TT51-1、非轉基因玉米，樣品均保存于中國檢驗檢疫科學研究院。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計。根據轉基因玉米MON810和MIR604的插入序列兩端設計DPO引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2.2 DNA提取。采用試劑盒法提取樣品基因組DNA，并用核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度，保存于-20 ℃備用。

1.2.3 多重DPO-PCR體系建立。參考Takara多重PCR試劑盒的反應體系：各引物終濃度均為0.4 μmol/L、DNA模板1.0 μL、Mix 1溶液0.25 μL、Mix 2溶液25 μL，用ddH2O調整反應體系的體積至50 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；72 ℃ 延伸10 min。PCR結束后，采用2.0%瓊脂糖電泳分析。

1.2.4 特異性評價。按照1.2.3多重DPO-PCR反應體系，以轉基因玉米MON810、轉基因玉米MIR604、轉基因玉米TC1507、轉基因玉米MON863、轉基因玉米BT176、轉基因玉米MON89034、轉基因大豆GTS40-3-2、轉基因油菜GT73、轉基因水稻TT51-1、非轉基因玉米的基因組DNA為模板，對多重DPO-PCR反應體系進行特異性評價。

1.2.5 靈敏度評價。將轉基因玉米MON810和MIR604的基因組DNA標定濃度為50.00 ng/μL，再將其濃度稀釋為5.000、0.500、0.050、0.005 ng/μL，分別取1 μL作為模板進行多重DPO-PCR擴增，進行靈敏度評價。

1.2.6 退火溫度敏感性試驗。按照1.2.3多重DPO-PCR反應體系，將退火溫度設為50～65 ℃，每5 ℃為1個梯度，共4個梯度，以轉基因玉米MON810和MIR604的基因組DNA混合物為模板進行退火溫度敏感性試驗。

2 結果與分析

2.1 多重DPO-PCR檢測方法建立

由圖1可知，建立了轉基因玉米MON810和MIR604的多重DPO-PCR檢測方法，多重DPO-PCR檢測結果與單重DPO-PCR檢測結果一致，即在266 bp和127 bp處有特異性條帶。

2.2 特異性評價

由表2可知，轉基因玉米MON810和MIR604為陽性，而其他8種非靶目標樣品均為陰性，所建立的多重DPO-PCR檢測方法特異性強。

2.3 靈敏度評價

由圖2可知，DNA模板含量在50.000、5.000、0.500 ng/μL時均可擴增出2條目的條帶，且呈依次減弱；當模板含量降到0.050 ng/μL以下時，未能擴增到目的條帶。

2.4 退火溫度敏感性試驗

由圖3可知，多重DPO-PCR在50、55、60、65 ℃這4個退火溫度梯度下均能擴增出目的基因，表明建立的多重DPO-PCR檢測方法對退火溫度不敏感。

3 結論與討論

試驗結果表明，設計的DPO引物特異性強，靈敏度達0.500 ng/μL，且對退火溫度不敏感，由此建立了多重DPO-PCR方法用于轉基因玉米MON810和MIR604的檢測。該方法特異性強、靈敏度高、對退火溫度不敏感，適用于食品、飼料等樣品中這2個轉基因玉米品系的快速篩檢。

4 參考文獻

[1] CLIVE JAMES.2015年全球生物技術/轉基因作物商業化發展態勢[J].中國生物工程雜志，2016，36（4）：1-11.

[2] CHUN J Y，KIM K J，HWANG I T，et al.Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene[J].Nucleic Acids Res，2007，35（6）：40.

[3] 張娜，乾義柯，魏霜，等.兩種向日葵檢疫性真菌病害的多重DPO-PCR檢測方法[J].植物檢疫，2015（6）：35-38.

[4] 李丹丹，徐義剛，王昱，等.創傷弧菌DPO-PCR檢測方法的建立[J].食品科技，2015，40（11）：287-290.

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[7] 徐義剛，李丹丹，劉忠梅，等.應用DPO-PCR方法特異性檢測志賀氏菌[J].中國畜牧獸醫，2014，41（3）：28-31.