外源GA3影響牡丹花芽DNA甲基化水平和相關酶基因的表達分析

張濤，司福會，張玉喜，蓋樹鵬

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外源GA3影響牡丹花芽DNA甲基化水平和相關酶基因的表達分析

張濤，司福會，張玉喜，蓋樹鵬

（青島農業大學生命科學學院/山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東青島 266109）

【目的】外施赤霉素（GA）是生產上輔助解除牡丹花芽休眠進行反季節盆花生產的常用手段，赤霉素如何發揮作用解除牡丹花芽休眠是未解的科學問題，本文旨在明確赤霉素是否通過表觀遺傳方式參與內休眠調控。【方法】從DNA甲基化入手，以4年生‘魯菏紅’為材料，500 mg·L-1的GA3處理花芽，并在處理后0.5、1、3和5 d后取健壯頂芽，CTAB法提取花芽DNA，HPLC技術測定GA3處理后牡丹花芽DNA甲基化水平的變化；利用轉錄組分析結合RACE技術得到牡丹3種DNA甲基轉移酶基因、、和DNA去甲基化酶基因的序列，生物信息學方法比對基因序列并分析可能的結構域，MEGA 5.0構建系統發育樹；以為內參，利用qPCR方法分析其組織表達特性和對GA3的響應。【結果】3種DNA甲基轉移酶基因（）的開放閱讀框長短不一，、、開放閱讀框長度分別為1 118、1 056、2 175 bp，編碼的氨基酸數目分別為372、351、724。3種DNA甲基轉移酶均有甲基轉移酶結構域。而DNA去甲基化酶基因的序列較長，開放閱讀框為6 636 bp，編碼2 211個氨基酸。上存在保守的DNA糖基化結構域。系統發育分析表明，牡丹中的PsCMT和PsDRM蛋白與葡萄的VvCMT2蛋白親緣關系最近，PsMET和PsROS1與大部分木本植物聚為一支，與煙草等距離較遠。、、在牡丹初花期的各個組織（根、莖、葉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮）中均有表達，其中在牡丹根中表達量較高，而在心皮中表達量最高。GA3處理5 d，牡丹花芽迅速萌動，60 d時萌動率為97.5%，成花率為92.5%；對照20 d時才有少量花芽萌動，至60 d時萌動率僅為23.1%。GA3顯著降低了牡丹花芽DNA甲基化水平（＜0.01），從處理前的38.9%降至處理5 d時的28.7%；GA3處理提高了和的表達水平，降低了的表達水平，而的表達水平差異不顯著。【結論】GA3處理通過誘導表達、抑制表達導致了DNA低甲基化，進而促進了牡丹休眠解除，可能是赤霉素發揮作用的一種重要方式。

牡丹；DNA甲基轉移酶；；赤霉素；DNA甲基化；休眠解除

0 引言

【研究意義】牡丹（Andr.）是中國著名的傳統觀賞花卉之一，同其他多年生木本植物一樣，其在自然條件下必須經過冬天一段時間低溫，才能解除休眠來年正常開花。足夠低溫累積是解除休眠的有效措施。低溫解除牡丹休眠進程中，甲基化水平是下降的[1]，暗示表觀遺傳修飾在其中發揮了重要作用。生產上，常用赤霉素輔助解除休眠，進行反季節花期調控生產。因此，明確赤霉素解除休眠是否與甲基化調控有關對于牡丹反季節生產具有重要意義。【前人研究進展】真核生物中，DNA胞嘧啶的甲基化與基因表達密切相關[2]，5-胞嘧啶的甲基化是最普遍的DNA修飾。胞嘧啶甲基化在多種生物發育過程中發揮關鍵作用，包括基因沉默、轉座子的失活和印記基因表達[3-4]。DNA甲基轉移酶（Dnmt）家族是植物進行甲基化修飾的工具，它能催化S-adenosylmethionine（SAM）上的甲基轉移到胞嘧啶嘧啶環的C-5位點，在表觀遺傳基因調控中起中心作用[5]。植物中的DNA甲基轉移酶主要包括甲基轉移酶、染色質甲基轉移酶、結構域重排甲基轉移酶這3類[6]。擬南芥中，主要維持重復序列和單拷貝DNA序列中CpG位點的DNA甲基化[7]。能維持重復和單拷貝DNA序列中CG類型的甲基化，并影響其形態特征[8]，是植物中特有的一類甲基化酶，可以在異染色質發生DNA甲基化，其功能主要是維持CHG位點的DNA甲基化[2,9]。另外，植物DNA去甲基化酶（repressor of silencing 1）是一種DNA糖基化酶，它可以去除DNA5-甲基胞嘧啶上的甲基而發動DNA的去甲基化過程。目前，其功能和特性僅在擬南芥中進行了較為詳細的研究[10]。【本研究切入點】關于赤霉素對甲基化影響的報道大都集中在模式植物上，在木本植物牡丹中的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】探究赤霉素促進休眠解除與DNA甲基化變化的潛在聯系，為進一步研究赤霉素解除休眠的機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為4年生‘魯菏紅’（‘Luhehong’）健壯植株，由菏澤牡丹研究所提供。2016年10月下旬定植于盆中，11月12日移入溫室，用500 mg·L-1的GA3處理花芽（棉花纏繞花芽，滴加GA3溶液1 mL），并在處理后0.5、1、3和5 d后取健壯頂芽，每組設3個重復，清水為對照；每處理15株，共90株，剝去鱗片后，液氮速凍后于-80℃保存備用。另取上述處理60株，移入溫室后60 d調查植株生長情況。取初花期（大風鈴期）牡丹花芽的各個組織（根、莖、葉、花瓣、萼片、苞片、雄蕊、心皮），每組取3個重復，用于組織表達分析。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）提取總RNA，-80℃保存。cDNA的合成按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa，大連）說明書進行。RACE- Ready-cDNA第一鏈合成按照SMARTer? RACE 5′/3′ Kit說明書進行。

1.3 RACE擴增和實時定量PCR

根據已知序列設計特異性引物進行RACE擴增。

反應條件：94℃ 30 s，72℃ 3 min，共5個循環；94℃ 30 s，70℃30 s，72℃3 min，共5個循環；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，共25個循環。

將反轉錄得到的cDNA稀釋3倍作為實時定量PCR反應的模板，設定3個技術重復。為內參，引物見表1，數據分析采用2-ΔΔCT法。Real-time PCR反應體系為20 μL，包括ddH2O 6.8 μL，SYBR Premix DimerEraser（2×）10.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，cDNA 2.0 μL。反應在Light Cycler 480 real-time PCR System上進行，反應條件參考司福會等[11]。

表1 引物相關信息

1.4 生物信息學分析

測序結果利用DNAMAN6.0進行分析和拼接，利用Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行蛋白質Blast對比并分析結構域。利用IBS 1.0.2繪制蛋白質結構域分布圖。系統發育樹采用MEGA 5.0中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建，置信度檢驗設置為Bootstrap=1 000。

1.5 甲基化水平的測定

利用CTAB法提取植物總DNA[12]，100℃加熱2 min使約5 μg DNA變性，迅速置于冰上。甲基化測定用Hasbun等的方法[13]，變性的DNA在37℃經核酸酶P1（Sigma）和堿性磷酸酶（Sigma）處理后，15 000×離心20 min，上清液經0.025 μm濾紙（Millipore，Bedford，MA）過濾，上樣Eclipse XDB-C18柱（5 μm，150×4.6 nm，Aglient）用于HPLC分析（Aglient 1100 Series），流動相為KH2PO3/ methanol（98﹕2，v/v），約20 min。標樣胞嘧啶（C）和甲基胞嘧啶（mC）購自Sigma。使用下列公式計算甲基胞嘧啶百分比：mC（%）=（mC/（C+mC））×100。

2 結果

2.1 赤霉素處理解除牡丹花芽休眠的效應

GA3處理后，牡丹花芽迅速萌動，處理5 d時，大部分花芽即已萌動；至60 d時調查，萌動率為97.5%，成花率為92.5%。對照萌動較晚，20 d時才有少量花芽萌動，至60 d時萌動率僅為23.1%，未見花朵開放，僅有5.1%的成花率（圖1）。可見，赤霉素處理可在一定程度上代替低溫，促進休眠解除，顯著提高萌動率和成花率。

2.2 赤霉素對甲基化水平的影響

利用HPLC分析了GA3處理后牡丹花芽的甲基化水平。由圖2可以看出，GA3處理顯著降低了花芽的甲基化水平，且隨著施加GA3天數的增加，花芽甲基化水平呈下降趨勢。從38.9%降至處理5 d時的28.7%，而對照甲基化水平維持在37.5%—41.5%，相對穩定。

A：對照 Control；B：500 mg·L-1 GA3處理 Treated with 500 mg·L-1 GA3

*P＜0.05；** P＜0.01。圖6同 The same as Fig. 6

2.3 甲基化相關酶基因的克隆

根據DNA甲基化相關酶基因保守序列，從轉錄組數據庫中篩選出相關片段[12]，其中（Accession number：MH038045）和（Accession number：MH087469）已包含完整的ORF，而（ID：JI448809）和（ID：JI448935）編碼序列不完整，進行了RACE擴增。根據目的基因的序列設計了特異性引物（表1），經過RACE PCR擴增，得到了997 bp的5′ RACE PCR產物和1 245 bp的5′ RACE PCR產物（圖3）。測序后利用DNAMAN與已知cDNA進行序列拼接，最終獲得1 506 bp的cDNA序列（Accession number：MH038046）、1 582 bp的cDNA序列（Accession number：MH038044）。開放閱讀框的長度為1 118 bp，編碼的氨基酸數目為372，蛋白質分子量為41.469 kD。開放閱讀框的長度為1 056 bp，編碼351個氨基酸，蛋白質分子量為39.853 kD。開放閱讀框的長度為2 175 bp，編碼724個氨基酸，蛋白質分子量為81.477 kD。含有6 636 bp的開放閱讀框，編碼2 211個氨基酸，分子量為246.675 kD。

在線分析牡丹和的序列表明，在152—269 aa間含有一個BAH結構域（The Bromo-adjacent homology domain），在311—375 aa間存在Cyt_C5_DNA_methylase結構域；在22—351 aa間存在一個SAM-dependent MTase C5-type結構域；在序列上找到兩個結構域，一個是位于232—276 aa間的UBA（Ubiquitin-associated domain）結構域，另一個是在393—723 aa的SAM-dependent MTase DRM-type結構域；上存在DNA糖基化結構域、HhH-GPD 結構域、Perm-CXXC結構域和RRM-DME結構域（圖3）。

為了解牡丹PsDRM、PsMET、PsCMT、PsROS1蛋白與其他植物相應基因的進化關系，對牡丹中4種DNA甲基化相關酶進行系統發育分析（圖4）。結果表明，PsCMT和PsDRM與葡萄的VvCMT2親緣關系最近，與模式植物擬南芥親緣關系較遠；PsMET和PsROS1與大部分木本植物聚為一支，比如胡楊，與煙草等距離較遠。

圖3 DNA甲基化酶（A）和去甲基化酶（B）的結構域

圖4 牡丹甲基化相關酶的系統發育分析

2.4 牡丹甲基化相關酶基因的組織表達特性

在牡丹的初花期（大風鈴期）取各個組織（根、莖、葉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮），利用熒光定量PCR對DNA甲基化酶基因的表達模式進行了分析。結果表明，、、在各個組織中均能檢測到表達，但表達量不同。和在根、莖、雄蕊和苞片中表達量相對較高，在葉片和心皮中較低；而在根中的表達量最高，在心皮中的表達量相對較高，其次為莖和萼片，在雄蕊中最低；在心皮中表達量最高，其次是萼片，在葉片和花瓣中表達較少（圖5）。

2.5 赤霉素對甲基化相關酶基因表達的影響

植物中的甲基化水平是由甲基化酶和去甲基化酶共同維持的[14]。因此，對相關酶基因進行熒光定量PCR分析（圖6）。結果表明，GA3處理的牡丹花芽與對照相比表達量差異不顯著（＞0.05）。用GA3處理后，的表達量在0.5 d內就有了大幅度的提高，這表明GA3顯著地提高了的表達水平，可快速響應GA3。GA3處理0.5—3 d，的表達明顯減弱。與此相反，經GA3處理后，去甲基化酶表達量顯著提高，且有逐漸增加的趨勢。

3 討論

DNA胞嘧啶甲基化、組蛋白修飾和RNA干擾（RNAi）是最常見的分子表觀遺傳學機制，在基因調控中發揮重要作用[14]。DNA胞嘧啶甲基化大約占總胞嘧啶的30%[15]，越來越受到人們的重視。DNA甲基化水平主要是由DNA甲基轉移酶和去甲基化酶創建和維持的。相關基因克隆和功能分析主要見于模式植物，但木本植物中相關基因克隆的報道較少。本研究從牡丹花芽中克隆了DNA甲基化酶基因、、和DNA去甲基化酶，序列分析表明具有相應保守結構域，并在不同組織中檢測到了它們的表達，暗示它們可能參與了牡丹細胞中DNA甲基化的調控。

1：根root；2：莖stem；3：葉Leaf；4：萼片sepal；5：苞片bract；6：花瓣petal；7：雄蕊stamen；8：心皮carpel

圖6 GA3處理后甲基化相關酶基因的表達水平

赤霉素是一種重要的植物激素，參與調控多種生長和發育過程[16]。目前已對赤霉素的生物合成和代謝途徑有了比較明確的了解[17]。然而，赤霉素在表觀遺傳調控中發揮怎樣的作用仍未可知。李梅蘭等[18]研究表明，在春化誘導不結球白菜開花期間，DNA甲基化水平降低與芽尖分生組織中內源GA含量增加存在間接關系。本研究表明，赤霉素導致牡丹的甲基化水平下降。已有研究表明，休眠解除進程中伴隨著DNA低甲基化[1,19]。因此，赤霉素處理導致DNA低甲基化，可能是其發揮作用促進休眠解除的一種重要方式。

另外，赤霉素處理可能通過調節DNA甲基化相關酶基因的表達而影響甲基化水平。從小麥幼苗和發芽胚的細胞核中純化的DNMT的活性受到GA3抑制，但GA3添加到小麥胚的核提取物中似乎刺激了DNA甲基化酶活性[20]。然而，在水稻中，外施GA3不會引起表達的顯著變化[21]。近期在煙草中的試驗表明，和響應GA3信號表達水平下降[14]。顯示了不同生物中的（、和）對GA響應是有差異的[19-23]。ROS1介導的主動去甲基化可以導致內外源基因的轉錄沉默[24]，引起5S rDNA染色質的解聚及植物對生物脅迫和環境脅迫的響應[25-27]。本研究中，GA3處理導致的表達量提高。CMT主要功能是維持CG位點甲基化，GA3處理促進了細胞分裂，需要CMT大量表達維持甲基化水平。DRM可導致CHG位點重頭甲基化，GA3處理后表達受到抑制，而表達量顯著提高，二者聯合作用，導致總體甲基化水平的下降。

4 結論

利用轉錄組分析和RACE技術，得到了牡丹DNA甲基轉移酶基因（、和）和DNA去甲基化酶基因，具有相應保守結構域。外施GA3顯著降低DNA甲基化水平，導致DNA低甲基化，進而促進了休眠解除，是赤霉素發揮作用的一種方式。DNA甲基化水平的降低可能與赤霉素誘導表達水平下降和表達量提高有關。

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（責任編輯 岳梅）

Effect of Exogenous Gibberellin on DNA Methylation Level and Expression of Related Enzyme Genes in Tree Peony Floral Buds

ZHANG Tao, SI FuHui, ZHANG YuXi, GAI ShuPeng

(College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University/Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province, Qingdao 266109, Shandong)

【Objective】 Application of exogenous gibberellin (GA) is a commonly method to break floral bud dormancy in the anti-season production of tree peony. However, the mechanism of how gibberellin plays a role in breaking dormancy of tree peony is an unsolved problem. The objective of this study is to clarify whether GA participates in dormancy regulation through epigenetic mode. 【Method】 In this study, 4-year-old ‘Luhehong’ was used as material, and 500 mg·L-1exogenous GA3was applied. Terminal buds were harvested and DNA was extracted at 0.5, 1, 3 and 5 d after GA3applied. The DNA of peony floral buds was extracted using CTAB method and DNA methylation level of floral buds was analyzed by HPLC technology. Three types of DNA methyltransferase genes,,and, and one DNA demethylase genewere obtained using RACE amplification based on transcriptome analysis. Bioinformatics method was performed to analyze gene sequences and possible domains, and MEGA 5.0 was used to construct phylogenetic tree. Usingas reference gene, the tissue expression characteristics and response to GA3of these genes were analyzed by qPCR method. 【Result】The open reading frame (orf) of the three DNA methyltransferases (Dnmts) varies in length. The orf lengthof,andis 1 118, 1 056 and 2 175 bp, respectively. The number of amino acids encoded is 372, 351 and 724, respectively. All three DNA methyltransferases have methyltransferase domains. The DNA demethylase genehas a long sequence with an ORF of 6 636 bp and encodes 2 211 amino acids, and there is a conserved DNA glycosylation domain in. Phylogenetic analysis indicated that the PsCMT and PsDRM proteins in peony were closely related to the VvCMT2 protein of grape, PsMET and PsROS1 were grouped with most woody plants and located far away from tobacco.,andwere expressed in all tissues (roots, stems, leaves, bracts, sepals, petals, stamens, carpels) at the early flowering stage of peony, and the expression level of,andwas higher in the root of peony than that of other tissues, while the expression level ofwas the highest in carpels. Application of GA3dramatically accelerated buds sprouting and flowering. Bud sprouting could be observed 5 d after GA3application, and the germinating rate of bud was 97.5% with a 92.5% flowering rate after 60 d of GA3application. But in the control group, only a few buds germinated at 20 d, and the germinating rate was only 23.1% at 60 d. GA3significantly decreased the DNA methylation level of peony bud (＜0.01), from 38.9% before treatment to 28.7% at 5 d after treatment. GA3treatment increased the expression ofand, decreased the expression level of, but there was no significant difference inexpression. 【Conclusion】GA3treatment inducesexpression and inhibitsexpression, which leads to DNA hypomethylation and thus promotes dormancy release of peony, which may be an important way for gibberellin to play its role.

; DNA methyltransferase;; gibberellin; DNA methylation; dormancy release

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.012

2018-04-16；

2018-06-19

國家自然科學基金面上項目（31372104，31672194）

張濤，E-mail：zhang1995tao@163.com。通信作者蓋樹鵬，E-mail：spgai@qau.edu.cn