溫敏水凝膠/磷酸三鈣生物復合材料的制備及其在小鼠體內的成骨研究

程麗佳， 陳 濤， 陳祖盛， 吳海慧， 牛 蓓

(成都大學 醫學院， 四川 成都 610106)

0 引 言

據報道，目前在全球范圍內每年都有近1 500萬骨折病例的發生，導致骨移植的市場需求量不斷增加[1-2].而由創傷、骨質疏松等原因造成的骨折和骨缺損具有一定的再生和自我修復能力，但人體骨的自我修復周期較長，且缺損超過一定大小，便不能自我修復愈合[3].嚴重的骨缺損需要通過骨移植來進行治療，而自體骨和異體骨取材十分有限，也存在著免疫排斥反應等限制了其應用[4].研究發現，含羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)和磷酸三鈣(Tricalcium Phosphate,TCP)的生物陶瓷因和骨組織具有相似的理化性質，以及良好的生物相容性、生物降解性、骨傳導性和骨誘導性而常被用作骨替代物[5-8].但鈣磷生物材料其粉體為無定形粉末，直接應用無法塑形，同時存在強度低、固化慢等缺點，影響了其臨床應用.溫敏水凝膠(Thermo-sensitive Hydrogel,TSH)聚合物是由一定比例的DL-丙交酯、乙交酯和聚乙二醇合成，其特點是在溫度低于相轉變溫度(25±2)℃時，聚合物可溶于水形成自由流動液體，而當溫度升高至相轉變溫度以上時，聚合物的水溶液形成凝膠形狀，且凝膠形成的過程是可逆的[9].同時，TSH又是一種高分子材料，可作為固化液，在體內可起到緩釋TCP的作用，其能將Ca、P離子緩慢釋放并誘導形成新生骨組織，可解決TCP粉體需要燒結成型的缺點.基于此，本研究擬利用TSH在低溫下溶解、高溫下固化的特點及TCP的骨誘導性，在二者協同作用下制備出一種生物力學特性與天然骨相似的新型骨修復/再生材料，擬為骨替代物材料的開發提供新的路徑.

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗所用的材料包括：TSH，購自濟南岱罡生物工程有限公司；HA、TCP，由四川大學生物材料中心贈送；BALB/c小鼠，購自成都達碩實驗動物有限公司.

1.2 TSH/TCP材料制備

稱取5 g TSH與20 mL蒸餾水混合，放置于4 ℃冰箱中，每24 h攪拌30 min進行混合，3 d后得到TSH混合懸浮液.然后，按24∶76的比例加入TCP粉體，將TCP粉體與TSH懸浮液進行混合,得到TSH/TCP混合材料.最后，將TSH/TCP混合材料置于27 ℃以上，加工制得TSH/TCP復合材料.根據其可任意塑形的特性，可按需放置在模具中制成所需的形狀.

1.3 材料結構

實驗采用邵氏硬度檢測材料硬度，利用掃描電子顯微鏡分析HA、β-TCP和TSH/TCP 3種生物材料的微觀結構.

1.4 動物實驗

30只7周周齡的BALB/c小鼠隨機分為3組(n=10)，即∶TSH/TCP組(實驗組)、HA組(對照組1)及β-TCP組(對照組2).實驗中，采用1%戊巴比妥鈉腹腔內麻醉(0.1 mg/g體重)所有小鼠，然后，對小鼠兩側大腿進行常規消毒、剃毛、備皮，切開皮膚和肌肉，制備肌袋，將3種生物材料分別植入肌袋，最后逐層縫合肌肉和皮膚.術后觀察小鼠正常活動，并注射青霉素1.2萬單位/g，5 d，預防感染.

1.5 組織學染色

術后12周，處死小鼠，解剖后觀察小鼠體內有無異物或腫瘤組織形成，同時收獲材料并置于10%中性福爾馬林固定24 h，10% EDTA(pH值為7.0)脫鈣，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，然后制成5 μm 厚連續切片，切片行蘇木素—伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson三色(Masson's trichrome)染色、番紅固綠(safranin-fast green,SFG)染色和亞甲基藍—酸性品紅染色，在光學顯微鏡下觀察新生骨組織形成情況.其中，HE染色使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色，可鑒定骨組織；Masson三色染色區分膠原纖維和肌纖維，可鑒定膠原組織；SFG染色觀察軟骨組織，可鑒定成骨途徑是否是軟骨內成骨；亞甲基藍—酸性品紅染色使骨組織染色，可鑒定成骨細胞和新生骨組織.

1.6 統計學分析

每個石蠟塊連續切片5張，HE染色切片于顯微鏡下采圖，用Image-Pro plus 6.0軟件對其中的新生骨組織面積進行統計，計算每組新生骨組織的面積百分數.所有數據以均數±標準差(x±s)表示，應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，所有數據采用Student T檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義.

2 結 果

2.1 材料特征

3種生物材料的掃描電鏡觀察結果如圖1所示.

圖1 HA、TCP和TSH/TCP 3種材料的掃描電鏡觀察結果

由圖1可見，HA材料硬度較大，孔隙率低，孔與孔之間互不連通；β-TCP材料硬度低，孔隙率較高，孔之間相互貫通，難以用作承重的骨移植材料；TSH/TCP復合材料，孔較多，孔隙率高，孔徑范圍在100 μm左右，能為纖維組織和骨組織提供通過和生長空間，起到骨組織的修復作用，且有TSH附著于材料中，起到塑形作用，大孔與小孔之間相連，更有利于血管的滲透，為新骨的生成提供營養.研究表明，人工骨的孔徑在15～40 μm之間時，纖維組織可以長入骨組織內部；當孔徑范圍在45～100 μm時，非礦物的骨樣可以長入骨內部；而當孔徑在150 μm時，骨組織可以長入材料內部[9].TSH/TCP邵氏硬度為62，硬度較HA和β-TCP大，具有良好的力學性能.

2.2 成骨性能比較

3種生物材料的HE染色結果如圖2所示.

注：三種生物材料細胞核呈藍色，骨組織、細胞質、肌纖維和膠原纖維呈深淺不一的紅色.

圖2 HA、TCP和TSH/TCP HE染色結果

圖2結果顯示，HA組中，未觀察到任何新生骨組織，僅有大量新生血管、纖維結締組織和間充質組織；β-TCP組中，新生骨組織在材料邊緣連片生長，這些新生骨組織已成熟為板層骨，材料內部有大量纖維結締組織長入；TSH/TCP 組中，大量新生編織骨組織遍布在材料中，成骨細胞鑲嵌在骨陷窩里，同時，骨組織周圍可見水凝膠附著在邊緣，有向材料內部長滿的趨勢.

2.3 骨組織鑒定

為鑒定TSH/TCP材料中形成的異位骨組織，進行了Masson三色染色、番紅固綠染色和亞甲基藍—酸性品紅染色，結果如圖3所示.

注：Masson三色染色中，膠原纖維呈藍色，細胞核呈深藍色；番紅固綠染色中，細胞漿、肌肉、膠原纖維及骨組織呈灰綠色，細胞核呈灰黑色；亞甲基藍—酸性品紅染色中，成骨細胞為深藍色，細胞基質為淡藍色，類骨質成紫灰色.

圖3骨組織鑒定結果

圖3結果顯示，成骨細胞沿著骨組織線性排列，骨陷窩鑲嵌在骨組織中，骨組織中的膠原纖維排列有序，兩種染色均未發現軟骨組織，表明材料誘導的異位骨組織是通過膜內成骨形成的.

2.4 新骨面積百分數

3種生物材料的新骨面積統計結果如表1所示.

表1 新骨面積百分數

從表1數據可以看出，HA組中沒有任何骨組織形成，TCP組中新骨面積百分數為(10.47±1.57)%，TSH/TCP組中新骨面積百分數為(8.30±1.38)%，P>0.05，兩組沒有明顯的統計學差異，表明TSH/TCP生物材料的成骨能力與TCP相當.

3 結 論

本研究所采用的TSH在溫度低于相轉變溫度(25±2)℃時，聚合物可溶于水形成自由流動液體，而當溫度升高至相轉變溫度以上，聚合物的水溶液形成凝膠形狀，凝膠形成的過程是可逆的，是一種良好的黏合材料，將其與TCP混合制備成TSH/TCP復合材料可提高TCP的硬度，并增加材料的彈性.目前，生物材料在大動物體內誘導異位骨形成的現象已被大量報道，而小鼠體內的骨誘導現象僅有零星的報道[10-11].本研究證實了，不管是傳統的TCP材料，還是新型的TSH/TCP材料，均能在小鼠體內誘導異位骨形成，此為探討骨誘導的機制提供了相關線索.同時，本研究還證明了，TSH/TCP材料不僅是一種具有良好的生物相容性、生物降解性和骨誘導能力的復合材料，而且制備方法簡單，應用時可按實際需要任意塑形.研究表明，TSH/TCP材料還具有與TCP材料相當的成骨能力，且有更強的硬度和更好的彈性，有望作為一種新型人工骨修復材料.