甘薯莖尖脫毒組培快繁技術(shù)研究

甘薯是我國重要的農(nóng)作物之一，年產(chǎn)量僅次于水稻、小麥和玉米。甘薯以其甘甜可口的特點深得人們的喜愛。此外，甘薯很容易種植，選擇水分大、不過于貧瘠的地方插入薯苗即可。因甘薯抗逆性強(qiáng)、用途廣等優(yōu)良品質(zhì)，在未來很有可能作為一種能源物質(zhì)用于乙醇的生產(chǎn)。

然而，病毒病卻一直影響著甘薯的產(chǎn)量，極大地阻礙了甘薯的生產(chǎn)，中國每年因甘薯病毒病造成的產(chǎn)量損失價值高達(dá)40億元。

當(dāng)前防治甘薯病毒病的方法通常是剝離莖尖分生組織，離體培養(yǎng)后得到脫毒苗來去除病毒，然后進(jìn)行培育、快繁，將脫毒種薯應(yīng)用于大規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上。多年來，世界上各個國家的科研人士致力于甘薯脫毒培養(yǎng)技術(shù)的研究，以尋求防治甘薯病毒病的最有效的方法，但由于病毒種類多、變異快，很難徹底杜絕甘薯病毒的存在。然而，莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)技術(shù)為有效防治甘薯病毒病開辟了一片新天地，是目前獲取和培養(yǎng)脫毒苗的最常用的手段。經(jīng)脫毒后的甘薯能恢復(fù)其品種原始的優(yōu)良性狀，采用快速繁殖技術(shù)將甘薯這些優(yōu)良品質(zhì)遺傳下去，以達(dá)到提高甘薯產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。該研究以商薯19莖尖為外植體，經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)、分化、增殖和生根培養(yǎng)，建立甘薯莖尖脫毒組培快繁技術(shù)，為生產(chǎn)優(yōu)良高質(zhì)量的甘薯組培脫毒苗提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

本研究所用的商薯19植株來自鄭州師范學(xué)院生物工程研究所。

（二）方法

1.無菌芽的獲得。選取健康無病斑的商薯塊，洗凈泥土，用1%高錳酸鉀處理15 min，0.5%多菌靈浸泡1 h后撈出晾干，置于滅菌水中（0.1%的多菌靈）恒溫（28℃）催芽，相對濕度80%～85%。薯芽萌發(fā)后，于35～40℃（8 h/d）下處理30天。當(dāng)薯芽長至10 cm時，用已消毒的解剖刀切下頂部約3 cm芽段，剪去已經(jīng)伸展的葉片，放入燒杯中進(jìn)行表面消毒，利用3種不同消毒方法（見表1）進(jìn)行消毒，再用已消毒的紗布吸干芽段外表的水分，置于無菌環(huán)境（超凈工作臺上）。

2.莖尖培養(yǎng)。切取莖尖頂端約1 cm長芽段，用已消毒的解剖刀在40倍解剖鏡下切除較大的葉原基，用解剖針切下位于莖尖頂端的生長點（生長點為扁平透明的突起）。切下后，用解剖針將莖尖頂端的生長點挑到裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行莖尖誘導(dǎo)，每個培養(yǎng)皿中接種數(shù)量一致（3～4個）。分別用3種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，編號A1、A2、A3，所用培養(yǎng)基及生長狀況（見表2）。

3.苗的增殖。莖尖15天后可分化出苗，然后可進(jìn)行增殖培養(yǎng)。此時，需從培養(yǎng)皿中將苗移植到培養(yǎng)瓶中，此過程應(yīng)注意保持無菌環(huán)境，避免污染，同時注意避免損傷苗的莖和葉。分別用3種不同培養(yǎng)基同時進(jìn)行培養(yǎng)，編號B4、B5、B6，每個培養(yǎng)瓶中接種的數(shù)量一致（3～5個），所用培養(yǎng)基及增殖狀況（見表3）。

4.脫毒苗根的誘導(dǎo)。脫毒苗快速繁殖可利用單莖葉來進(jìn)行，即在無菌條件下（在超凈工作臺上進(jìn)行），將莖尖苗剪切成小的莖段，每個莖段帶1節(jié)和1片葉，然后用鑷子將單莖葉的形態(tài)學(xué)下端扦插于培養(yǎng)基中，此過程容易污染，鑷子及解剖刀應(yīng)進(jìn)行頻繁消毒。然后加入生長調(diào)節(jié)劑來誘導(dǎo)單莖葉生根，側(cè)芽向上生長，得到一棵完整的植株。根的誘導(dǎo)也分為3組同時進(jìn)行，編號C7、C8、C9，每組所用培養(yǎng)基配比不同，所用培養(yǎng)基及根的誘導(dǎo)情況（見表4）。

5.培養(yǎng)條件。所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂9 g/L，pH值5.8～6.0，120℃滅菌 30 min，所有的培養(yǎng)溫度均為（24±2）℃，光照2500～3000 lx，光照時間為12 h/d。

二、結(jié)果與分析

（一）不同表面消毒方法對莖尖成活率的影響

由表1可知，外植體以處理A效果最佳，處理B效果次之，處理C效果最差。可見升汞的滅菌效果比次氯酸鈉好，從處理A和處理B對比不難得出，0.1%升汞滅菌的時間長短對莖尖成活率也有一定的影響。綜合不同滅菌方法的效果來看，最佳選擇是處理A。

（二）莖尖誘導(dǎo)

外植體莖段接種15天后觀察其生長狀況，在加入6-BA和NAA組合的培養(yǎng)基中，無菌芽伸長快，高度正常，并且芽呈綠色（見圖1）；在加入KT的培養(yǎng)基中，無菌芽伸長快，植株較高，芽黃綠色，說明KT的加入，莖尖誘導(dǎo)的效果不好；在不加入激素的MS培養(yǎng)基中，無菌芽伸長慢，植株高度不正常，芽黃綠色，說明莖尖誘導(dǎo)需要加入一定量的激素，莖尖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基最佳選擇為A1號（見表2）。

表1 不同消毒方法對莖尖成活率的影響

表2 不同培養(yǎng)基配比對莖尖誘導(dǎo)的影響

（三）苗的增殖

莖尖15天后可分化出苗（見圖2），30天后可增殖6～7片葉 (見圖3) 。從3種培養(yǎng)基的苗增殖情況可看出，6-BA可有效誘導(dǎo)苗的增殖，但較低濃度的效果不佳，6-BA與CW的組合效果最佳；6-BA與NAA的組合不利于葉的生長。綜合3種培養(yǎng)基中苗的長勢來看，適宜增殖的最佳培養(yǎng)基為B4號，苗生長快、健壯，葉大而綠（見表3）。

（四）生根培養(yǎng)

用已消毒的鑷子將單莖葉的形態(tài)學(xué)下端扦插于培養(yǎng)基中，通過生長調(diào)節(jié)劑的作用誘導(dǎo)單莖葉生根，側(cè)芽向上生長，形成一棵完整的植株（見圖4）。試驗表明，NAA有利于單莖葉的誘導(dǎo)生根，濃度稍高的NAA效果更好。綜合三種不同培養(yǎng)基中多數(shù)幼苗的生根情況來看，誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的最佳選擇為C7號，生根多而且健壯，有利于后期整棵植株的營養(yǎng)供應(yīng)（見表4）。

三、討論

莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)前獲取和培養(yǎng)脫毒苗的主要手段。本研究以商薯的莖尖為外植體，初步建立了甘薯的脫毒苗組培快繁體系。由于本試驗選取的研究對象是商薯19，因此，本試驗所建立脫毒苗快繁體系不一定完全適應(yīng)其他品種的甘薯。在實踐中，可根據(jù)事實情況酌情變動培養(yǎng)基的配比。

試驗表明：在商薯莖尖表面消毒過程中，通過本試驗發(fā)現(xiàn)，以0.1%的升汞滅菌6～7 min為宜，低于6 min外植體容易發(fā)生不同程度的污染，高于7 min外植體容易死亡，0.1%的升汞滅菌效果好于10%的次氯酸鈉。由于升汞對人體及環(huán)境有害，使用過的升汞應(yīng)做特殊處理，不能隨意丟棄。

脫毒苗快速繁殖技術(shù)的關(guān)鍵在于剝離的莖尖組織的誘導(dǎo)分化，在培養(yǎng)基中加入適量的6-BA和NAA有利于芽的誘導(dǎo)分化，但要注意濃度大小應(yīng)適中，過高或過低不僅不能誘導(dǎo)分化，反而起抑制作用。

在商薯苗的增殖培養(yǎng)階段，在培養(yǎng)基中加入適量的CW有利于苗的生長。但是要注意CW的濃度及用量，過高或過低都不能起到促進(jìn)苗增殖的作用。脫毒苗快速繁殖利用單莖葉來進(jìn)行，MS培養(yǎng)基和1/2 mS培養(yǎng)基是適合商薯生根的基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入適量的NAA有利于單莖葉的誘導(dǎo)生根，并且生出的根粗壯，有利于后期成苗的營養(yǎng)吸收。

配制培養(yǎng)基時，注意培養(yǎng)瓶封口的工作及培養(yǎng)基滅菌程序，避免污染培養(yǎng)基，影響商薯器官組織的成活率。此外，要注意培養(yǎng)基中添加的蔗糖和瓊脂的濃度，以及誘導(dǎo)愈傷組織形成器官時的光照和溫度，總之，要盡量給予商薯各組織器官生長的最適條件。

在將莖尖分化出的苗從培養(yǎng)皿移植到培養(yǎng)瓶中時，要注意輕輕夾取，避免用力過度而損傷莖和葉。同時試驗要在酒精燈旁操作，避免空氣中的細(xì)菌污染培養(yǎng)基及莖尖分化組織。此外，操作時動作要快，避免酒精燈熱量灼傷莖尖分化組織。

在剝離莖尖組織及切取單莖葉時，多次用到解剖刀、解剖針及鑷子，注意每次使用前后都要進(jìn)行頻繁的高溫消毒，避免污染商薯莖尖分生組織及單莖葉等，影響脫毒的成功率。此外，經(jīng)高溫消毒的鑷子、解剖刀和解剖針要冷卻后再使用，避免燙傷商薯幼苗的器官組織，影響成活率。

表3 不同培養(yǎng)基配比對苗的增殖的影響

圖1 莖尖誘導(dǎo)

圖2 莖尖分化

圖3 增殖培養(yǎng)

圖4 生根培養(yǎng)

表4 不同培養(yǎng)基配比對根誘導(dǎo)的影響