煙草半胱氨酸蛋白酶的特性和結構分析

楊柳　趙爽　殷雪艷　劉彪　羅萬麟

摘 要：通過生物大數據和檢測工具，對煙草半胱氨酸蛋白酶的序列特征、亞細胞定位、二級結構和三級結構進行分析。結果顯示，煙草半胱氨酸蛋白酶均具有信號肽，且含有組織蛋白酶前肽抑制劑結構域和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶；經初次亞細胞定位，NtCP-1，NtCP-2，NtCP-3和NtCP-4定位于細胞質，NtCP-5定位于液泡；二級結構中，NtCP-1，NtCP-2和NtCP-5的α-螺旋比例最大，而NtCP-3和NtCP-4以無規則卷曲比例最大；三級結構N-端聚集較為疏松，其二級結構以α-螺旋為主，C-端的二級結構以β-折疊為主。

關鍵詞：煙草；半胱氨酸蛋白酶；結構；特性

中圖分類號：S517 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.001

Characterization and Structure Analysis of Tobacco Cysteine Protease

YANG Liu， ZHAO Shuang， YIN Xueyan， LIU Biao， LUO Wanlin

（Liangshan Tobacco Company， Xichang， Sichuan 615000， China）

Abstract： Tobacco cysteine protease sequence characteristics， subcellular localization， secondary structure and tertiary structure were analyzed with large biological data and detection tools. The results showed that tobacco cysteine protease had a signal peptide， and contained a cathepsin propeptide inhibitor domain and a papain family cysteine protease. The initial subcellular localization， NtCP-1， NtCP-2， NtCP-3 and NtCP-4 were located in cytoplasm， and NtCP-5 was located in the vacuole. In the secondary structure， NtCP-1， NtCP-2 and NtCP-5 had the largest proportion of alpha helix， while NtCP-3 and NtCP-4 had the largest specific gravity in the random coil. The tertiary structure had looser N-terminal aggregation， its secondary structure was mainly α-helix， and the C-terminal secondary structure was mainly β-sheet.

Key words： tobacco； cysteine protease； structure； characteristics

半胱氨酸蛋白酶具有降解和儲存蛋白[1-2]、抵抗生物或非生物脅迫[3-6]、參與細胞的衰老和程序性的死亡等作用[7-8]，該蛋白酶一般在細胞質中生成前體性蛋白，再通過自身信號肽，轉運到特定的亞細胞結構如細胞壁和液泡等[9-10]，一般半胱氨酸的蛋白酶具有相對保守的結構域[11]，位于葉綠體的半胱氨酸蛋白酶降解核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）[12]。

烤后煙葉顏色是煙草收購標準之一[13]，主要受鮮煙葉色素含量和烤中煙葉變黃的影響，即受細胞衰老和色素的影響，而半胱氨酸蛋白酶與植物的細胞衰老和色素降解有關[14]。本研究對煙葉半胱氨酸蛋白酶的特性和結構進行分析，旨在為其進一步研究和應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 煙草半胱氨酸蛋白酶家族成員的獲取

運用NCBI[15]數據庫，檢索并提取煙草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列，其登錄號分別為ABW71226.1，BAA96501.1，ACB70409.1，AAW7866 0.1和ADV41672.1，并分別對其進行命名NtCP-1，NtCP-2，NtCP-3，NtCP-4和NtCP-5[16]。

1.2 方 法

采用結構域分析工具SMART[17]，對煙草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸數、信號肽位置、結構域成分以及結構域分布進行分析；運用TargetP 1.1在線服務[18]，獲取煙草半胱氨酸蛋白酶的亞細胞結構；采用NPSA-PRABI工具[19]，測定煙草半胱氨酸蛋白酶的β-轉角、β-折疊、α-螺旋和無規則卷曲，分析序列的二級結構；采用SWISS-MODEL工具[20]，根據同源相似原理，構建煙草半胱氨酸蛋白酶的三級結構。

2 結果與分析

2.1 煙草半胱氨酸蛋白酶的序列特征

通過分析蛋白酶的氨基酸序列，有利于了解其功能特性，因此，采用SMART對NtCP進行序列特征的分析，結果如表1所示。NtCP的氨基酸數量無明顯波動，介于349～361，其中，NtCP-1和NtCP-2相同（360），NtCP-3和NtCP-4相同（361），NtCP-5的氨基酸數最小（349）；NtCP各成員都含有信號肽，均位于N-端；均含有組織蛋白酶前肽抑制劑結構域（Inhibitor_I29），但存在的位置有所不同，其中，NtCP-1和NtCP-2的所在位置相對靠后，處于61～121，而NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5的所在位置較為靠前，處于38～99；均含有木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶（Pept_C1），其位置分布規律同Inhibitor_I29較為相似。

2.2 煙草半胱氨酸蛋白酶的亞細胞定位和二級結構分析

為明確NtCP位于煙草中的亞細胞結構，對其氨基酸序列進行分析，詳情如表2所示。NtCP-1、NtCP-3和NtCP-4可能定位于細胞質、內質網、液泡或類囊體結構中，其中NtCP-1和NtCP-4定位于細胞質的可能性最大，而NtCP-3定位于細胞質和內質網的可能性最大；NtCP-2可能定位于細胞質、液泡、類囊體或細胞外，但定位于細胞質內的可能性較大；NtCP-5可能定位于液泡、類囊體或細胞外，可能主要位于液泡內。為進一步探究NtCP二級結構的穩定性，對蛋白序列中的β-轉角、β-折疊、α-螺旋和無規則卷曲分布及其成分進行分析，結果如圖1所示。β-轉角于序列內的分布較為分散，其在NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5序列內所占比例依次為11.67%，11.94%，10.25%，10.25%和10.03%；β-折疊一般存在于第50位氨基酸序列之后，其于各序列中所占比例依次為20.00%，18.89%，20.22%，19.11%和14.90%；α-螺旋主要分布在氨基酸序列的0～100和150～250，所占比重依次為38.06%，39.17%，30.47%，31.86%和39.83%；無規則卷曲無明顯分布規律，所占比重依次為30.28%，30.00%，39.06%，38.78%和35.24%。

2.3 煙草半胱氨酸蛋白酶的三級結構分析

利用HHBlits和Blast的同源比對法，以NtCP的氨基酸序列為依據，檢索SWISS-MODEL的三級結構數據庫，經篩選，以蛋白原的晶體結構，以及2.70 Amb a 11和2.05 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一種主要的豚草花粉過敏原）的晶體結構為模板，其序列分別1cs8.1，5egw.1，45ef4.1，構建NtCP的三級結構，結果如圖3所示。NtCP-1和NtCP-2依據蛋白原的晶體結構，構建其相關的三級結構（圖2-A），NtCP-1和NtCP-2氨基酸序列的覆蓋率均為0.82%，且含有的β-折疊、β-轉角和α-螺旋數依次為21，27，11個；NtCP-3和NtCP-4依據2.70 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一種主要的豚草花粉過敏原）的晶體結構，構建其相關的三級結構（圖2-B），其序列的覆蓋率均為0.92%，NtCP-3二級結構數依次為17，35，12個，NtCP-4的依次為18，37，12個；NtCP-5依據的晶體結構為2.05 Amb a 11半胱氨酸蛋白酶（一種主要的豚草花粉過敏原），構建三級結構（圖2-C），為單體，且具有4組GOL配體，序列的整體覆蓋率為0.89%，其二級結構數依次為18，35，14個。NtCP的三級結構均以N-端聚集較為疏松，且N-端的二級結構以α-螺旋為主，C-端的二級結構以β-折疊為主。

3 結論與討論

通過對煙草半胱氨酸蛋白酶的序列特征分析可知，NtCP均含有信號肽，即屬于分泌蛋白，且經過初次亞細胞定位，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均位于細胞質，NtCP-5位于液泡；二次定位之后，存在亞細胞的位置發生變化，NtCP-1和NtCP-2定位于液泡，NtCP-3定位于內質網和類囊體，NtCP-4定位于內質網，而NtCP-5被分泌于細胞外。因此，推斷NtCP的功能具有多樣性[12]。煙草半胱氨酸蛋白酶均含有2個功能結構域，分別為組織蛋白酶前肽抑制劑結構域和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶，說明該蛋白具有較高的保守性，且具有2種蛋白的功能[21]；NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5的α-螺旋比例均最大，有利于保證三級結構的穩定，而NtCP-3和NtCP-4以無規則卷曲的比例最大，不利于三級結構的穩定[16]；N-端的二級結構以α-螺旋為主，C-端的二級結構以β-折疊為主，表明NtCP的功能域可能位于中間和C-端序列。

參考文獻：

[1]BECKER C， SENYUK V I， SHUTOV A D， et al. Proteinase A， A storage-globulin-degrading endopeptidase of vetch （ Vicia Sativa， L.） seeds， is not involved in early steps of storage-protein mobilization[J]. European journal of biochemistry， 1997， 248（2）： 304-312.

[2]GRUDKOWSKA M， ZAGDASKA B. Multifunctional role of plant cysteine proteinases[J]. Acta biochimica polonica， 2004， 51（3）： 609-624.

[3]HAO L， HSIANG T， GOODWIN P H. Role of two cysteine proteinases in the susceptible response of Nicotiana benthamiana to Colletotrichum destructivum and the hypersensitive response to Pseudomonas syringae pv. tomato[J]. Plant science， 2006， 170（5）： 1001-1009.

[4]ROJO E， MARTN R， CARTER C， et al. VPEgamma exhibits a caspase-like activity that contributes to defense against pathogens[J]. Current biology cb， 2004， 14（21）：1897.

[5]MACIEL F M， SALLES C M C， RETAMAL C A， et al. Identification and partial characterization of two cysteine proteases from castor bean leaves （Ricinus communis L.） activated by wounding and methyl jasmonate stress[J]. Acta physiologiae plantarum， 2011， 33（5）：1867-1875.

[6]SIMOVASTOILOVA L， VASEVA I， GRIGOROVA B， et al. Proteolytic activity and cysteine protease expression in wheat leaves under severe soil drought and recovery[J]. Plant physiol biochem， 2010， 48（2/3）：200-206.

[7]KUSAKA K， TADA Y， SHIGEMI T， et al. Coordinate involvement of cysteine protease and nuclease in the executive phase of plant apoptosis[J]. Febs letters， 2004， 578（3）： 363-367.

[8]BHALERAO R， KESKITALO J， STERKY F， et al. Gene expression in autumn leaves[J]. Plant physiology， 2003， 131（2）： 430-442.

[9]FISCHER J， BECKER C， HILLMER S， et al. The families of papain- and legumain-like cysteine proteinases from embryonic axes and cotyledons of Vicia seeds： developmental patterns， intracellular localization and functions in globulin proteolysis[J]. Plant molecular biology， 2000， 43（1）： 83-101.

[10]OKAMOTO T， MINAMIKAWA T. A vacuolar cysteine endopeptidase （SH-EP） that digests seed storage globulin： Characterization， regulation of gene expression， and posttranslational processing[J]. Journal of plant physiology， 1998， 152（6）： 675-682.

[11]吳建忠.輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因生物信息分析[J]. 西部林業科學， 2015（5）： 1-7.

[12]閆龍鳳，楊青川， 韓建國， 等. 植物半胱氨酸蛋白酶研究進展[J]. 草業學報， 2005（5）： 11-19.

[13]閆新甫， 馬建偉， 王英元， 等.卷煙企業調入煙葉的等級質量分析[J]. 煙草科技， 2006（8）： 55-59.

[14]UEDA T， SEO S， OHASHI Y， et al. Circadian and senescence-enhanced expression of a tobacco cysteine protease gene[J]. Plant molecular biology， 2000， 44（5）：649.

[15]EDGAR R， DOMRACHEV M， ALEX E， et al. Gene expression omnibus： NCBI gene expression and hybridization array data repository[J]. Nucleic acids research， 2002， 30（1）： 207-210.

[16]陳二龍， 蘇家恩， 范志勇， 等. Bright Yellow 2烤煙熱激蛋白90生物信息學分析[J]. 南方農業學報， 2017， 48（10）： 1734-1740.

[17]SCHULTZ J， MILPETZ F， BORK P， et al. SMART， a simple modular architecture research tool： identification of signaling domains[J]. Proceedings of the national academy of sciences， 1998， 95（11）： 5857-5864.

[18]ZYBAILOV B， RUTSCHOW H， FRISO G， et al. Sorting signals， n-terminal modifications and abundance of the chloroplast proteome[J]. PloS one， 2008， 3（4）： e1994.

[19]趙潔， 趙立卿， 鞏校東，等. 玉米大斑病菌Homeobox轉錄因子家族全基因組鑒定及其表達規律分析[J].中國農業科學， 2017， 50（4）： 669-678.

[20]GUEX N， PEITSCH M C， SCHWEDE T. Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer： A historical perspective[J]. Electrophoresis， 2009， 30（S1）： 162-173.

[21]劉回民，陳方奇，劉景圣. 植物中C1半胱氨酸蛋白酶的研究進展[J]. 食品工業， 2014（12）： 222-225.