反相高效液相色譜法測定穿龍骨刺片中薯蕷皂苷的含量

喻貴英 劉偉霞 羅偉 洪贇 汪楊

（太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司 重慶 401336）

穿龍骨刺片具有補(bǔ)腎、健骨、活血、止痛的功效。主要用于骨質(zhì)增生，骨刺疼痛的治療。該產(chǎn)品收載于《中國藥典》2015年版一部，由穿山龍、淫羊藿、狗脊、川牛膝、熟地黃和枸杞子等6味藥物組成。穿山龍為方中主藥，具有祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)的功效，臨床用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。而薯蕷皂苷為穿山龍藥材的主要指標(biāo)成份。在《中國藥典》2015年版一部穿龍骨刺片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用高效液相色譜法測定穿山龍的水解產(chǎn)物薯蕷皂苷元的含量來控制產(chǎn)品質(zhì)量，該方法中需要使用甲醇、三氯甲烷、乙腈，且用量較大，樣品前處理時間較長。為了減少有毒有害試劑的使用，縮短檢驗時間，保持與穿山龍藥材質(zhì)量控制指標(biāo)一致，便于制劑的質(zhì)量控制，盡可能減少對人體及環(huán)境的影響，本文對穿龍骨刺片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。

1.實驗方法

1.1 儀器

安捷倫高效液相色譜儀HP-1260（自動進(jìn)樣器G1329B、紫外檢測器G1315D），KQ-500DBB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

穿龍骨刺片樣品由桐君閣藥廠提供，薯蕷皂苷（批號：111707-201402，含量以96.2%計）由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈為色譜純，水為二次純化水（一級純化水），其余為分析純。

1.3 色譜條件

色譜柱為安捷倫Eclipse XDB-C18 250mm×4.6mm，5μm；流動相為乙腈：水（50:50）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長203nm；進(jìn)樣體積：10μl 。

1.4 供試品溶液制備

取適量樣品，研細(xì)，取樣品0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，密塞，稱定重量，超聲（40kHz，500W）處理30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 對照品溶液制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每ml含0.2mg的溶液，即得。

2.方法學(xué)考察

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（50:50）為流動相；流速為1.0ml/min；檢測波長為203nm；柱溫：30℃。采用安捷倫C18（Eclipse XDB-C18 250mm×4.6mm，5μm）色譜柱測定，結(jié)果理論板數(shù)按薯蕷皂苷峰計算均不低于3800。

2.2 陰性對照實驗

為進(jìn)一步考察試驗的合理性，取不含穿山龍的陰性對照樣品，依正文所述方法進(jìn)行測定。結(jié)果陰性樣品色譜在與薯蕷皂苷峰相應(yīng)的保留時間附近無干擾峰檢出，從而證明本方法是合理可行的。結(jié)果見下圖。

圖1 薯蕷皂苷對照圖

圖2 陰性對照圖

圖3 穿龍骨刺片樣品圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品20.55mg（按96.2%計算含量），置25ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密量取上述稀釋液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；依次操作，分別制成濃度為790.764μg/ml、395.382μg/ml、197.691μg/ml、98.846μg/ml、49.423μg/ml的對照品溶液，分別注入液相色譜儀，進(jìn)樣體積10μl。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程為：Y=363.18X-4.3469（相關(guān)系數(shù)r=1.0）。進(jìn)樣量在0.49423～7.90764μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，符合外標(biāo)法定量測定的要求。

2.4 精密度試驗

分別取濃度為790.764μg/ml、49.423μg/ml的對照品溶液，照正文方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μl，記錄峰面積，高、低濃度的對照品峰面積RSD均為0.3%，結(jié)果表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗

取本品（批號16010001），照正文方法，獨立測定6份，平均值為2.9mg/片，RSD為0.6%，結(jié)果表明重復(fù)性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品（批號14010001） 溶液，分別在0小時、4小時、12小時、24小時、48小時等不同時間點，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，不同時間點峰面積的RSD為0.7%，結(jié)果表明樣品溶液在48小時內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 回收率試驗

精密稱取已知含量的本品細(xì)粉約0.25g（批號：16010001，每克中含薯蕷皂苷5.96mg）6份做基底，分別精密加入薯蕷皂苷對照品溶液（濃度790.764μg/ml）2ml，照正文方法進(jìn)行測定，計算回收率，平均回收率為100.9%，RSD為0.6%，結(jié)果表明回收率較好。

2.8 樣品測定結(jié)果

依照正文方法對10批留樣品進(jìn)行了含量測定，每片含薯蕷皂苷在2.4mg至3.0mg之間。考慮到藥材的批間差異、生產(chǎn)批次間的生產(chǎn)偏差、藥物之間的相互作用及藥物的穩(wěn)定性等影響因素，建議將穿龍骨刺片的含量限度制定為“每片含穿山龍以薯蕷皂苷計，每片不得少于2.0mg。

3.討論

3.1 在穿龍骨刺片原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（《中國藥典》2015年版一部）中含量檢測指標(biāo)為薯蕷皂苷元，是通過對樣品進(jìn)行提取、酸水解、萃取而得的薯蕷皂苷元。從產(chǎn)品的工藝分析，在整個生產(chǎn)過程中，穿山龍藥材部分取粉，部分滲漉，不存在水解。采用原方法需使用甲醇、三氯甲烷、乙腈等試劑，且用量較大，對人體及環(huán)境都有一定的影響，檢驗時間長，檢驗成本高。且穿山龍藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)也為薯蕷皂苷，為了便于原料與產(chǎn)品生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制，采用正文方法更適宜。

3.2 本實驗通過不同取樣量（0.25克、0.5克、0.7克、1.0克）、溶媒種類（70%甲醇、70 %乙醇， 50%乙醇）、超聲時間（30分鐘、45分鐘、60分鐘）、稀釋倍數(shù)等因素進(jìn)行考察，最后確定樣品的制備選擇取0.5g樣品，加70%乙醇25ml超聲提取30min為宜， 該方法操作簡便易行。

3.3 本實驗中，比較了乙腈-水（55:45、50:50）兩種不同比例的流動相， 通過實驗發(fā)現(xiàn)乙腈-水（50:50）作為流動相較好，樣品分離度好，薯蕷皂苷保留時間適宜，陰性對照無干擾；并對目標(biāo)色譜峰的純度進(jìn)行了檢測，純度因子符合規(guī)定。

3.4 本實驗比較了安捷倫HP1200、HP1260和島津LC-20AT等3種型號的液相色譜儀，以及安捷倫、資生堂不同廠家的色譜柱，結(jié)果表明不同廠家的儀器、C18色譜柱對薯蕷皂苷含量無顯著性差異。