RP-HPLC測定硫酸羥氯喹片有關物質的方法學研究

阮圓張婷閆超王彥

1上海交通大學 （上海 200240）2上海上藥中西制藥有限公司 （上海 201806）

硫酸羥氯喹（HCQ）是4-氨基喹酮類抗瘧藥，由2個芳香環構成，氯喹中的一個乙基被一個羥乙基代替，也是一種獨特的抗風濕病藥物。1944年人工合成，20世紀50年代隨著抗瘧藥在系統性紅斑狼瘡(SLE)和類風濕性關節炎(RA)治療中的應用[1]，硫酸羥氯喹用于風濕性疾病治療的療效獲得肯定。因其獨特的作用機制和較好的安全性，硫酸羥氯喹在臨床風濕病領域的應用越來越廣泛。20世紀90年代以后，臨床90%以上的風濕病治療選用硫酸羥氯喹[2]。

隨著對其作用機制的深入研究，硫酸羥氯喹的應用范圍逐漸擴大：目前已廣泛用于治療類風濕性關節炎、盤狀紅斑狼瘡（DLE）、系統性紅斑狼瘡[3]、青少年慢性關節炎，以及由陽光引發或加劇的皮膚病變；對皮肌炎、扁平苔蘚、原發性干燥綜合征（SS）、遲發性皮膚卟啉病（PCT）等也有一定的療效。目前，美國藥典（USP）標準和中華人民共和國國家標準及部頒標準中，羥氯喹的測定均采用薄層色譜法。經研究發現，利用薄層色譜法來檢測硫酸羥氯喹的有關物質時，存在專屬性不強、靈敏度低的問題，且薄層色譜法只能檢出有關物質的限度，而不能測定出準確的雜質含量。英國藥典（BP）雖采用高效液相色譜法（HPLC）測定，但樣品制備步驟復雜。本文參考發明專利［4］，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對分析羥氯喹有關物質的方法學進行研究，樣品制備步驟簡便，色譜條件簡單，方法準確且專屬性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1200，1260型全自動高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；AL 104電子天平、S 20精密pH計，梅特勒-托利多國際有限公司。

1.2 試藥

硫酸羥氯喹片（批號為T140904，藥用級），上海中西制藥有限公司；硫酸羥氯喹工作用對照品（批號為140707，w=99.1%），甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；磷酸二氫鉀（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和測定法

以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Waters Symmetry C8柱，150 mm×5 μm）；以甲醇-磷酸二氫鉀溶液（將2.72 g磷酸二氫鉀溶解在900 mL水中，加入2 mL三乙胺，用1 mol/L氫氧化鉀或磷酸調節pH至8.0，再加水至1000 mL）作為流動相（梯度）；檢測波長為254 nm。梯度洗脫表見表1。由表1可知，梯度洗脫時緩沖液中磷酸二氫鉀與甲醇的體積比選取53∶47。在該條件下進行等度洗脫時，雜質分離不佳，運行時間過長。

表1 梯度洗脫表

測定法：取供試樣品細粉適量，用稀釋液（由甲醇與磷酸二氫鉀溶液按體積比1∶1配制，下同）制成每1 mL中約含硫酸羥氯喹1.0 mg的溶液，濾過，取續濾液作為供試品溶液；精密量取1 mL供試品溶液，置于100 mL容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。精密量取上述兩種溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。

2.2 專屬性試驗

2.2.1 樣品專屬性試驗

通過使用強光照射、高溫、酸水解、堿水解和氧化的方法對供試樣品進行加速破壞，以研究可能的降解產物和降解途徑，同時考察方法的專屬性。

取供試樣品細粉適量，精密稱定，用稀釋液制成每1 mL中含硫酸羥氯喹1.0 mg的溶液，濾過，取續濾液作為未破壞的供試品溶液。酸、堿破壞樣品在稀釋前加入對應量的堿或酸調節pH至中性。同法完成酸、堿空白輔料干擾試驗。在上述色譜條件下，精密量取各破壞條件下的溶液20 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，結果見表2。

表2 有關物質-專屬性試驗結果

由表2可知，各破壞條件下產生的雜質的峰能與主峰有效分離，說明色譜條件專屬性較強。

2.2.2 空白輔料干擾

取空白輔料適量，采用上述樣品專屬性試驗方法，對空白輔料用強光照射、高溫、酸水解、堿水解和氧化的方法進行加速破壞，經破壞的空白輔料溶液均不干擾樣品中雜質的檢測。

2.3 線性試驗

精密稱取硫酸羥氯喹工作用對照品0.025 7 g置于25 mL量瓶中，用稀釋液制成每1 mL中含硫酸羥氯喹1.0 mg的線性貯備液，再分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL 置于 100 mL 量瓶中，加入稀釋液稀釋至刻度，搖勻，制成相當于對照溶液質量濃度的40%～160%的線性溶液。分別精密量取上述線性溶液各20 μL進樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行回歸，結果如表3所示。

由表3可知，在0.004 112～0.016 448 g/L范圍內，硫酸羥氯喹質量濃度與峰面積線性關系良好。

2.4 精密度試驗

2.4.1 重復性

取同一批號T140904（0.1 g）的供試樣品，按有關物質測定法配制成供試品和對照溶液，平行測定6次并對結果進行評判。經測定，雜質質量分數分別為 0.68%，0.62%，0.62%，0.63%，0.64%，0.61%，平均總雜質質量分數為0.63%，表明方法重復性良好。

表3 硫酸羥氯喹線性回歸試驗結果

2.4.2 中間精密度

中間精密度考察隨機變動因素對精密度的影響，主要的變動因素為測定人員、測定儀器設備、測定日期等，6次試驗的平均總雜質質量分數為0.60%，與重復性試驗的平均總雜質質量分數（0.63%）相比，相對標準偏差（RSD）不大于10%，表明方法中間精密度良好。

2.5 檢測限與定量限

精密量取稀釋液20 μL注入液相色譜儀中，記錄電信號約為0.0903 mAU；精密稱取硫酸羥氯喹工作用對照品適量，用稀釋液稀釋至質量濃度為300 ng/mL的溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀中，主成分峰與基線噪音的信噪比為9.8，10.2，10.2；用稀釋液稀釋成質量濃度為100 ng/mL的溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀中，主成分峰與基線噪音的信噪比為 3.2，3.6，3.6。

從以上試驗可得，在本色譜條件下，硫酸羥氯喹的檢測限為100 ng/mL，定量限為300 ng/mL。

2.6 溶液穩定性試驗

取同一批號T140904（0.1 g）的供試樣品，按有關物質測定法配制成供試品，分別于0，2，4，6，8，10，12，14，16，18 h 進樣，考察主峰峰面積的日內穩定性，結果見表4。

表4 樣品溶液日內穩定性試驗結果

不同時間進樣的主峰峰面積的RSD為0.93%，測定結果均無顯著變化，表明供試樣品在18 h內基本穩定。

2.7 準確度試驗

精密稱取硫酸羥氯喹工作用對照品（批號：140707）適量，按處方量加入空白輔料，設計3個不同質量濃度（分別為80%、100%、120%）,制成每1 mL含硫酸羥氯喹0.01 mg的混合溶液。每個質量濃度分別配制3個供試品溶液，按色譜條件進行回收率測定，結果見表5。實驗結果顯示平均回收率為99.52%，RSD為1.03%，表明準確度較好。

表5 硫酸羥氯喹有關物質測定準確度試驗結果

2.8 耐用性試驗

使用色譜柱Waters Symmetry C8（150 mm×5 μm）將色譜條件中的參數作適度變化（如對流速、柱溫等參數作微小調整），對測定結果進行比較，數據見表6。

對柱溫在20～30℃，流速在0.8～1.2 mL/min之間變化進行耐用性考察，結果顯示柱溫和流速對主成分及雜質的保留時間有影響，但是對相對保留時間沒有影響，表明本方法耐用性良好。

3 結果與討論

（1）取甲醇與磷酸二氫鉀溶液體積比為47∶53的緩沖液作為流動相進行梯度洗脫，不僅可提高分離度，也可縮短試驗時間。

（2）硫酸羥氯喹在0.004 112～0.016 448 g/L質量濃度范圍內線性良好，回歸方程為：y=365 33x-3.56,R=0.999 5，檢測限為100 ng/mL，定量限為300 ng/mL。

本RP-HPLC法色譜條件簡單，檢測快速、準確、專屬性強，可用于羥氯喹有關物質的測定。

表6 T140904（0.1 g）耐用性試驗結果