乳酸菌貯存過程中耐濕保護劑的篩選

董佩佩，辛國芹，汪祥燕，劉元香，徐海燕，谷 巍，鄭軍紅

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

益生菌作為一種飼料添加劑在飼料工業和畜禽養殖中得到了廣泛的應用，然而益生菌的活力易受貯存時間和貯存條件的影響（李鑫，2011），如乳酸菌對高溫、氧氣、壓力、水分等外界條件敏感（黃滄海，2003；劉亞林，1994），不能抵抗貯存時的不良條件，從而導致其生物活性作用降低，產品質量不穩定。

飼料中耐濕保護劑需要有較強的吸水性能。魔芋是我國的傳統食品及醫藥資源，在現代食品加工業以及工業和醫療保健中具有巨大的開發潛力。以魔芋粉為原料的可食用干燥劑，對純水的吸收可達到 500～2000倍 （張靜和段勇，2004）。海藻糖是由兩個葡萄糖分子經α，α-1，1糖苷鍵連接的非還原性雙糖（簡文杰等，2003），生物保護作用機制一般認為海藻糖的生物保護機構能夠強力地束縛水分子，與膜脂質共同擁有結合水或海藻糖本身起到代替結合水的功能，從而防止生物體膜和膜蛋白等的變性（黃春秋，2005）。許多研究表明外加海藻糖能夠降低冷干過程對細胞膜、脂質體等的傷害作用（潘艷和何勝江，2010；戴秀玉等，2000）。Diniz-Mendes等（1999)研究發現添加外源海藻糖可顯著提高酵母細胞的存活率；黃成垠等（1997)研究發現，干燥條件下海藻糖對膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶和辣根過氧化物酶等三種醫用診斷工具酶的活性具有明顯的保護作用。

耐濕保護劑除了要求具有吸水性強外還需要有較強的抗結塊作用。抗結劑要求吸濕性強，流動性好，對各種動物無毒、無害，安全可靠（陳文靜等，2009；Renniep 等，1999）。 我國許可使用的抗結劑目前有5種：亞鐵氰化鉀、硅鋁酸鈉、磷酸三鈣、二氧化硅和微晶纖維素。劉仁植等（2015）研究表明亞鐵氰化鉀可以抑制石材孔隙中氯化鈉鹽結晶。微晶纖維素是屬于半合成高分子化合物，具有纖維素I的晶格特征，結晶度高于原纖維素且具有極強的吸水性，在水介質中經強力剪切作用后具有生成凝膠體的能力。而其也帶有許多空隙，由纖維素與水結合，所以具有吸附、保持水等特性（張彩莉和張鑫，2006）。二氧化硅的抗結塊機理與微晶纖維素類似（黃英雄和華聘聘，2002）。

本試驗立足于益生菌的應用現狀，通過在乳酸菌載體中添加耐濕保護劑，篩選出適于乳酸菌貯存的保護劑，減少濕度對乳酸菌活力的影響，從而達到延長其貯存時間的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 植物乳桿菌BLCC2-0001、BLCC2-0015、屎腸球菌 BLCC2-0012、戊糖片球菌BLCC2-0026。

1.1.2 培養基 液體培養基：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 10 g/L、酵母膏 5 g/L、檸檬酸銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀 5 g/L、硫酸錳0.2 g/L、 硫酸鎂 0.5 g/L、 吐溫-80 1 g/L，pH 6.0，121℃滅菌30 min，接入純培養的乳酸菌，37℃靜置培養 24 h。

乳酸桿菌瓊脂培養基（LBS）和乳酸球菌瓊脂培養基（EF）為市售。

1.1.3 載體 石粉、玉米淀粉、輕質碳酸鈣，比例為 4∶3∶3。

1.1.4 耐濕保護劑 魔芋粉、亞鐵氰化鉀、磷酸三鈣、二氧化硅、微晶纖維素。

1.1.5 試驗菌劑 將4株乳酸菌分別接種于液體培養基中，培養好的4株菌液分別于8000 r/min離心10 min，收集菌泥。然后分別與奶粉溶液（奶粉∶蔗糖=25∶8）混勻，凍干機凍干，制得單一益生菌菌劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 貯存過程中乳酸菌活力的測定 將無保護劑的載體石粉、玉米淀粉、輕質碳酸鈣按4∶3∶3比例混合，制成載體，分裝于塑料袋中，每袋裝100 g；然后將各乳酸菌制劑分別定量添加到載體中，混合均勻，置于溫度為（28±0.5）℃，濕度為（70±2）%的環境中，密封保存30 d，定期取樣測定載體中乳酸菌活菌數。

1.2.2 單一耐濕保護劑組乳酸菌活力測定 將5種保護劑分別添加到分裝的載體中，分別添加定量菌粉，混合均勻。不添加保護劑組為對照組（CK）。置于溫度為（28±0.5）℃，濕度為（70±2）%的環境中，密封保存30 d，定期取樣測定載體中乳酸菌活菌數。各保護劑添加量分別為魔芋粉2%、亞鐵氰化鉀0.002%、磷酸三鈣2%、二氧化硅1.5%、微晶纖維素2%。

1.2.3 不同保護劑組合添加組乳酸菌活力測定將由單一保護劑篩選得到的效果較好保護劑進行組合添加到分裝的載體中，分別添加定量菌粉，混合均勻。不添加保護劑組為對照組（CK）。置于溫度為（28±0.5）℃，濕度為（70±2）%的環境中，密封保存30 d，定期取樣測定載體中乳酸菌活菌數。各組合中保護劑添加量由單一保護劑添加量進行參考設計正交試驗。

1.2.4 混合載體中乳酸菌活菌數的測定 準確稱取10 g樣品，裝入盛有90 mL 0.90%滅菌生理鹽水的錐形瓶內，在搖床上振蕩30 min，制成1∶10的樣品溶液，將此溶液作梯度稀釋后，分別吸取1.0 mL稀釋菌懸液放入無菌平板中，加入適量相應培養基，充分混勻。每個梯度2個重復，室溫下靜置5～10 min后，將平板倒置于37℃恒溫培養48 h，選取30～300個菌落之間的平板進行計數。

2 結果與分析

2.1 貯存過程對乳酸菌活性的影響 由圖1可以看出，在30 d貯存期內，隨著貯存時間的延長，各菌株的活菌數有不同程度的變化。4株乳酸菌活菌數對數值 （lg cfu/g）從高到低依次為C2-0026、C2-0012、C2-0001、C2-0015， 分別下降了0.50、2.28、3.95、5.43。 在溫度為（28±0.5）℃，濕度為（70±2）%的環境中，戊糖片球菌C2-0026的抗逆性最強，其次是屎腸球菌C2-0012，植物乳桿菌C2-0001、C2-0015的抗逆性較差。

圖1 載體中乳酸菌活性隨時間的變化

2.2 單一耐濕保護劑對乳酸菌貯存的影響 由圖 2 可知，在溫度為（28±0.5）℃，濕度為（70±2）%的環境中，4株乳酸菌與不同保護劑混合貯存過程中活菌數變化差別較大，但各保護劑對菌株的死亡均有一定的延緩作用。微晶纖維素和魔芋粉對乳桿菌C2-0001和C2-0015在高濕度條件下貯存起到一定的保護作用，效果好于二氧化硅和亞鐵氰化鉀，貯存30 d存活率均比對照組高3%左右，另外磷酸三鈣對C2-0015的保護效果也較好。

二氧化硅和魔芋粉對球菌C2-0012和C2-0026在高濕度條件下貯存能夠起到保護作用，其效果好于其他3種保護劑。對于C2-0012，貯存30 d二氧化硅組和魔芋粉組活菌數與其他組差異顯著，分別比CK組高0.75、0.81 lgcfu/g。對于BLCC2-0026，魔芋粉對菌株的保護作用顯著，貯存30 d活菌數比對照組高0.20 lgcfu/g。

圖2 4株乳酸菌與不同保護劑混合活菌數隨貯存時間變化

2.3 不同保護劑組合對乳酸菌貯存的影響 由單一保護劑對乳酸菌貯存影響試驗中篩選到魔芋粉、二氧化硅、磷酸三鈣和微晶纖維素4個重要因素作為研究對象，選用4因素3水平L9正交表，以貯存22 d活菌數為指標通過正交試驗來尋求各保護劑之間最佳配比。將BLCC2-0012菌粉與各組合配方分別添加到載體中，混合均勻，置于溫度為（28±0.5）℃，濕度為（70±2）%的環境中密封保存，定期取樣計數。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平%

表2為貯存22 d活菌數的結果，活菌數極差R分析結果表明RC＞RB＞RD＞RA，即各因素主次關系為磷酸三鈣＞二氧化硅＞微晶纖維素＞魔芋粉。BLCC2-0012最佳耐濕保護劑組合為A3B2C3D3，即最佳耐濕保護劑組合為魔芋粉1%、二氧化硅1%、磷酸三鈣2%、微晶纖維素2%。驗證試驗結果表明，相同溫濕度條件下，相同添加量BLCC2-0012菌粉，該組合保護劑中貯存22 d活菌數為9.50 lg cfu/g。

表2 正交試驗結果

3 結論

本研究中4株乳酸菌對同一溫濕度環境的抗逆性不同，2株球菌的抗逆性強于兩株桿菌，球菌中戊糖片球菌C2-0026對濕度的抗逆性強于屎腸球菌C2-0012。在貯存過程中，各保護劑對菌株的死亡均有一定的延緩作用，但不同保護劑對不同菌株的保護作用略有差異。微晶纖維素、魔芋粉和磷酸三鈣對乳桿菌C2-0001和C2-0015在高濕度條件下貯存的保護作用優于二氧化硅和亞鐵氰化鉀，二氧化硅和魔芋粉對球菌C2-0012和C2-0026在高濕度條件下貯存的保護作用優于其他三種保護劑。將魔芋粉、二氧化硅、磷酸三鈣和微晶纖維素作為正交試驗的4個考察因素，進行L9（34）試驗設計結果表明，屎腸球菌C2-0012最佳耐濕保護劑組合為魔芋粉1%、二氧化硅1%、磷酸三鈣2%、微晶纖維素2%，在初始添加量為 5.0×109cfu/g，溫度為（28±0.5）℃，濕度為（70±2）%條件下貯存22 d，貯存載體中C2-0012活菌數為3.17×109cfu/g，存活率為63.40%，而未添加保護劑組相同條件下貯存22 d，存活率為16.04%，篩選得到的配方中C2-0012存活率提高47.36%。