威寧紫蘇原花青素提取及抗氧化活性

閆莉莉，祿 露，魯連芳

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威寧紫蘇原花青素提取及抗氧化活性

閆莉莉，祿 露，魯連芳

（銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300 ）

基于單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，獲得了威寧紫蘇葉片原花青素的最佳提取工藝，主要參數(shù)為：乙醇濃度85%、料液比1:25、微波功率（300 W）、微波時(shí)間30 s，該工藝條件下原花青素的粗得率為6.4 mg/g，純化制品得率為0.64%，樣品純度為86.54%。當(dāng)所提取的原花青素濃度為0.008 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基清除率可達(dá)54.21%，對(duì)Fe3+的總還原能力最強(qiáng)。說明紫蘇原花青素具有一定的抗氧化活性。

紫蘇； 原花青素； 抗氧化活性

0． 引言

紫蘇（）為唇形科一年生草本植物[1]，主要分布于我國(guó)江蘇、云南和貴州等20多個(gè)省市。威寧縣地處海拔2200米，氣候環(huán)境適宜紫蘇生長(zhǎng)，紫蘇資源豐富。紫蘇為藥食同源植物，其葉富含氨基酸、原花青素、紫蘇寧和矢車菊素3,5-二葡糖苷等特有的活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]。近年來，關(guān)于紫蘇中紫蘇籽油[1]、花色素苷[4]、咖啡酸[5]、黃酮類及微量元素[6]等活性成分研究較多，而對(duì)其中原花青素的提取及抗氧化活性的相關(guān)報(bào)道較少。

原花青素（Oligomeric proanthoyanidins, OPC），是一種富含雙黃酮衍生物的天然多酚化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基活性[7]，可廣泛應(yīng)用于護(hù)肝解毒[8]、消炎抗癌[9-10]、降血壓[11]、治療心血管[12]等疾病。目前市售的原花青素產(chǎn)品多來源于黑枸杞[13]、葡萄籽[14]、黑莓[15]和紫薯[16]提取物，而紫蘇提取物的原花青素產(chǎn)品較少。

為充分利用貴州威寧縣當(dāng)?shù)刭Y源，對(duì)紫蘇葉原花青素的提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行研究，為原花青素資源的開發(fā)提供參考。

1．材料與方法

1．1．材料與試劑

新鮮紫蘇葉片采自于貴州省威寧縣。

主要試劑有：原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥95%，20 mg/支，購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)）；甲醇、無水乙醇、石油醚、丙酮、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、三氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀均為分析純；0.05 mol·L-1磷酸緩沖液由0.05 mol·L-1Na2HPO4溶液和0.05 mol·L-1K2HPO4溶液組成，使用前按一定比例混合，并調(diào)節(jié)好pH值；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1．2．主要儀器

T6新世紀(jì)型紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用有限公司）；MM823EC8-PS（X）型微波爐（廣東美的集團(tuán)有限公司）；KA-1000型低速臺(tái)式離心機(jī)（800～4000 rmp，杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）。

1．3 方法

1．3．1．原花青素的提取

取自然晾干的紫蘇葉，用粉碎機(jī)粉碎，稱取紫蘇干粉2.00 g，加入一定量80%乙醇溶液，在一定微波功率下加熱處理1 min，然后在4000 r/min條件下離心5 min，上清液用石油醚萃取除去葉綠素等雜質(zhì)，部分待測(cè)樣品用熱稀酸處理，得到酒紅色的原花青素離子。

1．3．2．最佳提取條件的確定

保持其他條件不變，分別考察浸提劑濃度、料液比、微波時(shí)間、微波功率對(duì)原花青素提取得率的影響，并用正交試驗(yàn)確定各因素最佳值。

1．3．3．紫蘇葉原花青素的純化

對(duì)1.3.2中最佳工藝所得原花青素，采用結(jié)晶純化法[17]。原花青素提取液置于60%的甲醇中，并于室溫浸泡6 h，以60～70 ℃水浴加熱15 min，將提取液減壓濃縮，待液體濃縮成漿糊狀時(shí)停止操作，再用乙醇和乙醚洗滌濃縮物，用溫水溶解不溶部分，過濾以后加入等體積的乙醇于冰箱靜置5 h，再一次過濾將雜質(zhì)除去，將濾液在30～40 ℃條件下減壓蒸干，取殘?jiān)⑷苡诶湔麴s水，向容器中加入2倍的乙醇，放置冰箱靜置12 h，待容器底析出棕色晶體，為進(jìn)一步提純，再次將其溶解于60 ℃的50%乙醇中，過濾后將濾液在30～40 ℃下減壓濃縮，在冰箱靜置12 h，結(jié)晶分離后，即得棕色原花青素。

1．3．4．原花青素的含量測(cè)定

以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同等條件下，測(cè)定原花青素提取液的吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紫蘇原花青素的濃度，按公式（1）換算出原花青素的得率，并按公式（2）計(jì)算純度。

式中，c為原花青素濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；M為原料質(zhì)量，mg。

本研究根據(jù)垃圾填埋場(chǎng)的特點(diǎn)，建立了沼氣產(chǎn)氣模型，并進(jìn)行了相應(yīng)沼氣發(fā)電機(jī)組的設(shè)計(jì)；根據(jù)沼氣機(jī)組的余熱特點(diǎn)，提出了利用余熱進(jìn)行發(fā)電的方案。利用沼氣發(fā)電機(jī)組發(fā)電，不僅解決了沼氣的去處問題，還通過發(fā)電產(chǎn)生了一定的效益。利用機(jī)組余熱，通過ORC循環(huán)進(jìn)行發(fā)電，進(jìn)一步提高了沼氣發(fā)電的效率，具有節(jié)能環(huán)保高效的特點(diǎn)。

式中，m1為產(chǎn)物中原花青素的質(zhì)量，mg；m0為產(chǎn)物質(zhì)量，mg。

1．3．5．紫蘇葉原花青素·OH清除率的測(cè)定

采用Fenton法進(jìn)行測(cè)定。在25 mL反應(yīng)體系中，依次加入3 mL 7.5 mmol/L FeSO4、1%H2O2溶液，搖勻后再加3 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻并于37 ℃水浴中加熱15 min，在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)其吸光度A0。然后分別加入一定量不同濃度的待測(cè)液，繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測(cè)其吸光度Ax，并按（3）式計(jì)算·OH的清除率。

式中，A0為未加待測(cè)樣品吸光值，Ax為加待測(cè)樣品的吸光值。

1．3．6．紫蘇葉原花青素總還原能力的測(cè)定

分別取濃度為0.002、0.003、0.004、0.005 L、0.006、0.007、0.008 mg/ mL的原花青素試樣1 mL，分別依次加入pH=6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）溶液2.5 mL，待混合均勻后于50℃水浴20 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液2.5 mL混合，取混合液2.5 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%氯化鐵2.5 mL和蒸餾水2.5 mL，混合靜置10 min，在波長(zhǎng)為700 nm處測(cè)其吸光度。

2．結(jié)果與分析

2．1．原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

y=2.3761x+0.012 (R2=0.9985) （4）

2．2．單因素實(shí)驗(yàn)

2．2．1．乙醇濃度的影響

在浸提時(shí)間為35 s、微波功率為440 W、料液比為1:20、提取1次的條件下，不同乙醇濃度對(duì)紫蘇原花青素得率的影響如圖2所示。隨著乙醇的濃度增加，得率逐漸增加，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，如果再增加濃度，原花青素的得率會(huì)下降，因此，最佳浸提濃度應(yīng)在80%左右。

圖2 濃度乙醇對(duì)原花青素提取的影響

圖3 料液比對(duì)原花青素提取的影響

圖4 微波時(shí)間對(duì)原花青素提取的影響

2．2．2．料液比的影響

在乙醇濃度為80%、提取時(shí)間為35 s、微波功率440 W、提取1次的條件下，不同料液比對(duì)紫蘇中原花青素浸提效果如圖3所示。可知，隨著料液比的不斷增加，得率呈逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比增加到1:20時(shí)，得率相對(duì)最高。

2．2．3．提取時(shí)間的影響

在乙醇濃度80%、微波功率440 W、料液比為1:20、提取1次的條件下，微波時(shí)間對(duì)紫蘇原花青素得率的影響如圖4所示。可知，隨著微波時(shí)間的加長(zhǎng)，得率不斷增加，當(dāng)微波時(shí)間超過35 s時(shí)，乙醇揮發(fā)較多，得率降低。

2．2．4．微波功率的影響

在乙醇濃度80%、微波時(shí)間為30 s、料液比為1:20、提取1次的條件下，微波功率對(duì)紫蘇花青素得率的影響如圖5所示。可知，隨著微波功率的增加，得率不斷增加，當(dāng)微波功率大于440 W時(shí)，原花青素得率下降。

圖5 微波功率對(duì)原花青素提取的影響

2．3．正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)對(duì)微波時(shí)間，微波功率，乙醇濃度，料液比四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每組實(shí)驗(yàn)做三次平行實(shí)驗(yàn)。因素水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

Tab.1 factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。可看出A因數(shù)的極差最大，故影響紫蘇中原花青素的得率最大因素為微波功率，其次是乙醇濃度、料液比，影響最小的因素為微波時(shí)間，根據(jù)K值的大小可知，紫蘇原花青素提取的最優(yōu)條件為A2B1C3D3，即微波功率為300W，微波時(shí)間為30 s，乙醇濃度為85%，料液比為1:25。此條件下原花青素的粗得率為6.4 mg/g。

2．4．原花青素的純化及含量測(cè)定

采用1.3.3和1.3.4方法對(duì)原花青素進(jìn)行純化并計(jì)算含量，原花青素的粗得率為6.4 mg/g，純化后得率為0.64%，樣品純度為86.54%。

2．5．抗氧化活性分析

原花青素濃度與羥基清除率之間的關(guān)系如圖6所示。由圖可知，隨著原花青素濃度不斷增加，清除率逐漸增大，當(dāng)原花青素濃度達(dá)到0.008 mg/ mL時(shí)，清除率可達(dá)到54.21%。

2．6．總還原能力分析

原花青素的總還原能力如圖7所示。由圖可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，原花青素對(duì)Fe3+的總還原能力與其濃度成正比，當(dāng)濃度為0.008 mg/ mL時(shí)還原能力最強(qiáng)。

3．結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)，并在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得出在提取時(shí)間為30 s、微波功率為300 W、乙醇濃度為85%、料液比為1:25的條件下可達(dá)最佳提取效果，得到原花青素的浸提取量為6.4 mg/g。通過結(jié)晶法純化的原花青素得率為0.64%，純度為86.54%，且具有較強(qiáng)的清除羥基自由基能力和還原能力。

圖6 原花青素對(duì)Fenton體系產(chǎn)生·OH的清除作用

圖7 原花青素總還原能力

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Extraction and Antioxidation Properties of Oligomeric Proanthoyanidins fromin Weining County

YAN Lili, LU Lu, LU Lianfang

( College of Material and Chemical Engineering, Tongren University, Tongren 554300, Guizhou, China )

Based on single factors and orthogonal experiments, the optimum extraction conditions of oligomeric proanthoyanidins fromleaves in Weining county was obtained: ethanol concentration 85%, solid-liquid ratio 1:25, microwave power 300 W, microwave time 30 s. The crude yield of oligomeric proanthoyanidins was 6.4 mg/g. The yield of purified products was 0.64%, and the purity of samples was 86.54%. The scavenging rate of hydroxyl radical reached 54.21%, and the total reduction ability of Fe3+was the strongest at the concentration of oligomeric proanthoyanidins 0.008 mg/mL.It shows that perilla seed anthocyanin has certain antioxidant activity.

, oligomeric proanthoyanidins, antioxidant activity

R284.2

A

1673-9639 (2018) 09-0001-05

2018-03-30

貴州省普通高等學(xué)校產(chǎn)學(xué)研基地（黔教合KY 字[2015]346）；貴州省教育廳大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練中心項(xiàng)目 （2016SJDCZX001）；2017 年第二批產(chǎn)學(xué)合作協(xié)同育人項(xiàng)目（201702108094）。

閆莉莉（1984-），女，河南周口人，碩士，講師，研究方向：電分析化學(xué)與抗氧化，E-mail: yanli0919@126.com.

（責(zé)任編輯 楊凱旭）（責(zé)任校對(duì) 謝 勇）