肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)記物及miRNAs在肺癌患者血清中的表達(dá)及意義*

葉火林，高淑平，劉漢起，畢向軍，孫成暉，譚艷玲

(廣東省陽(yáng)春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 5236000)

肺癌是病死率最高的惡性腫瘤，國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肺癌患者5年生存率僅為16.1%，大部分的患者屬于非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌主要分為腺癌和鱗癌兩大類[1]。雖然目前對(duì)于肺癌的治療技術(shù)已經(jīng)有了較大的發(fā)展，但肺癌患者的病死率仍然較高，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)肺癌早期患者5年生存率達(dá)到45%～65%，而晚期肺癌患者5年生存率為14%，由此可見(jiàn)肺癌早發(fā)現(xiàn)和早治療能夠明顯降低肺癌患者的病死率[2]。因肺癌早期癥狀并不明顯即使有癥狀也不典型，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)的患者有50%的均為良性，且針對(duì)早期病變不明顯者也不易發(fā)現(xiàn)，所以對(duì)提高肺癌早期診斷率并沒(méi)有太大的幫助，若果進(jìn)行超聲內(nèi)鏡、纖維支氣管鏡或肺穿刺活檢等檢查方式則對(duì)患者創(chuàng)傷較大且只是針對(duì)已經(jīng)有影像學(xué)改變的患者，部分患者不愿意接受[3]。血清腫瘤標(biāo)記物(sTM)檢測(cè)簡(jiǎn)便快捷，且只進(jìn)行抽血檢查，對(duì)患者創(chuàng)傷小，目前已被廣泛地運(yùn)用于肺癌的輔助診斷、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后判斷[4]。miRNAs是一種高度保守的非編碼調(diào)控短鏈RNA，長(zhǎng)度為20～24 nt，主要與發(fā)育、造血、器官的形成、凋亡和癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，最新的研究發(fā)現(xiàn)，血清/血漿中存在有大量穩(wěn)定的miRNAs可為肺癌的診斷提供參考[5]。目前對(duì)于血清腫瘤標(biāo)記物(sTM)與miRNAs的檢測(cè)均以單獨(dú)檢測(cè)的形式進(jìn)行，聯(lián)合檢測(cè)方面并未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，本文將sTM與miRNAs進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)旨在進(jìn)一步提高肺癌的早期診斷率提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年4月至2017年8月本院呼吸內(nèi)科收治的患者與常規(guī)體檢受試者105例進(jìn)行回顧性分析。根據(jù)患者身體狀況分為3組，對(duì)照組為肺部良性病變患者共35例，其中男17例，女18例；肺結(jié)核瘤5例，肺炎9例，支氣管囊腫4例，錯(cuò)構(gòu)瘤8例，支氣管擴(kuò)張9例。觀察組患者為經(jīng)纖維支氣管鏡取樣活檢和病理切片檢驗(yàn)確診為肺癌的患者35例，其中男20例，女15例；鱗癌13例，腺癌17例，小細(xì)胞肺癌5例；TNMⅠ期5例，Ⅱ12例，Ⅲ13例，Ⅳ5例。健康組為本院進(jìn)行常規(guī)體檢的健康受試者共35例，經(jīng)影像學(xué)等檢查未發(fā)現(xiàn)有癌癥，且無(wú)癌癥家族史。

1.2儀器與試劑 由美國(guó)R&D Systems公司生產(chǎn)的Luminex 200流式熒光檢測(cè)儀，在檢測(cè)前先用儀器專用配套的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品進(jìn)行校準(zhǔn)，在進(jìn)行校準(zhǔn)質(zhì)控后方可進(jìn)行標(biāo)本的檢測(cè)。sTM指標(biāo)選擇細(xì)胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC-Ag)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原153(CA153)的檢測(cè)試劑均購(gòu)于R&D Systems公司。QPCR分析儀由美國(guó)賽默飛世爾公司生產(chǎn)，UVmini-1240型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)由日本島津公司生產(chǎn)，miRcute miRNA 提取分離試劑盒與熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自于美國(guó)賽默飛世爾公司，miR-1、Let-7及表達(dá)內(nèi)參miR-22引物由廣州銳博生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1sTM檢測(cè)方法 取患者清晨靜脈血5 mL，在3 000 r/min下進(jìn)行離心10 min，取血清置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?dāng)天完成檢測(cè)。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag、CA125、CA153，具體的檢測(cè)參數(shù)均按說(shuō)明書要求進(jìn)行設(shè)置。陽(yáng)性參考值采用R&D Systems公司推薦標(biāo)準(zhǔn)：CYFRA21-1>3.3 ng/L、NSE>16.3 ng/L、SCC-Ag>1.5 ng/L、CA125>35 U/mL、CA153>40 U/mL。

1.3.2miRNAs檢測(cè)方法 (1)將冷凍保存的血清標(biāo)本迅速地進(jìn)行復(fù)溫處理，復(fù)溫完成后取400 μL融解血清進(jìn)行RNA樣本的制備，具體操作按miRcute miRNA試劑盒的要求進(jìn)行，RNA最終用焦碳酸二乙酯(DEPC)水融解，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)下進(jìn)行RNA提取純度檢測(cè)，純度達(dá)到吸光度(OD)260/280>1.8方可進(jìn)行下步操作。(2)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20 μL反應(yīng)體系dNTPmix(100 mmol/L)0.2 μL，Multiscrible逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)1.0 μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，RNA酶抑制劑(20 U/μL)1 μL，去核酸酶水9.8 L，混合逆轉(zhuǎn)異物1 μL引物，RNA5 μL。具體操作按Takara公司試劑盒要求進(jìn)行，混勻后離心在冰上放置。RT-PCR反應(yīng)條件：16 ℃，5 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min；4 ℃保存。(3)以2×SYBR Green熒光熒光定量預(yù)混合液10 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(以1∶20進(jìn)行稀釋)2 μL，去核酸酶水7.0 μL，引物1 μL。QPCR分析儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，45 s共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.13組受試者sTM與miRNAs測(cè)量值對(duì)比 3組受試者sTM與miRNAs比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且除miR-1與Let-7肺癌患者測(cè)得值明顯低于其他組外，肺癌患者各指標(biāo)測(cè)得值均明顯高于其他兩組(P<0.05)，見(jiàn)表1、2。

表1 3組受試者sTM指標(biāo)比較

續(xù)表1 3組受試者sTM指標(biāo)均值比較

表2 3組受試者miRNAs水平比較

2.23組受試者sTM指標(biāo)、miRNAs指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌診斷效能對(duì)比 各sTM指標(biāo)、miRNAs指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)AUC值為0.828～0.953，聯(lián)合診斷AUC值最大(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖1。

表3 3組受試者sTM指標(biāo)、miRNAs指標(biāo)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌診斷效能對(duì)比

圖1 3組受試者sTM指標(biāo)、miRNAs指標(biāo)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌診斷效能ROC曲線

3 討 論

肺癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率極高，提高治療成功率的關(guān)鍵是早診斷與早治療，目前最為可靠的肺癌診斷方法為纖維支氣管鏡、縱隔鏡或胸腔穿刺等方法取樣活檢，但活檢對(duì)患者創(chuàng)傷較大，耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高，且一般用于懷疑惡性腫瘤者，對(duì)于早期癌癥篩查和連續(xù)性監(jiān)測(cè)則無(wú)能為力[6-8]。sTM是指特征性存在于惡性腫瘤細(xì)胞或因惡性腫瘤細(xì)胞異常增殖、宿主對(duì)腫瘤刺激反應(yīng)等產(chǎn)生，并能反映腫瘤的發(fā)生，用于監(jiān)測(cè)腫瘤狀態(tài)的一類物質(zhì)，在腫瘤普查、診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)等方面扮演著越來(lái)越重要的角色，其檢測(cè)費(fèi)用較低、方便快捷[9]。sTM的檢測(cè)方法主要有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫法、電化學(xué)發(fā)光免疫分析等，但這些所得到的結(jié)果一般都以單指標(biāo)的形式進(jìn)行檢測(cè)分析，而單一指標(biāo)檢測(cè)特異性不強(qiáng)，對(duì)于早期癌癥檢出率不高，容易出現(xiàn)漏診而延誤患者的病情。大部分癌癥患者體內(nèi)可能存在多種的sTM，而一種sTM也可能存在與多種腫瘤中，因此單指標(biāo)檢測(cè)仍無(wú)法滿足對(duì)癌癥的診斷要求。miRNA屬于小分子RNA的一種，其核苷酸片段只有21～24個(gè)，主要起到調(diào)控蛋白質(zhì)合成的作用，與細(xì)胞的發(fā)育、分化及凋亡均有密切關(guān)系，逐漸被應(yīng)用于癌癥的診斷。為提高肺癌的早期檢出率，臨床上常對(duì)sTM進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，而對(duì)于sTM與miRNAs聯(lián)合檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道并不多，本文對(duì)sTM與miRNAs進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)旨在為肺癌的診斷提供參考。

3組受試者sTM與miRNAs指標(biāo)均有差異，且除miR-1與Let-7肺癌患者測(cè)得值明顯低于其他組外，肺癌患者各指標(biāo)測(cè)得值均明顯高于其他兩組(P<0.05)。本文結(jié)果顯示肺癌患者體內(nèi)miR-1水平明顯低于肺部良性病變患者與健康受試者，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道稱miR-1在肺癌原發(fā)病灶陽(yáng)性率明顯低于癌旁和正常組織的結(jié)果相似，miR-1是近年來(lái)新被發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，研究顯示miR-1在肺癌細(xì)胞中表達(dá)較低，轉(zhuǎn)染miR-1后肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)被明顯抑制，提示miR-1與肺癌的發(fā)生與疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。Let-7是最早被發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)聯(lián)的miRNA，有研究者曾將穩(wěn)定表達(dá)Let-7的肺癌細(xì)胞注入大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與未注射的大鼠相比，腫瘤的生長(zhǎng)明顯得到了抑制，從該實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)Let-7在腫瘤組織中的表達(dá)量與原發(fā)腫瘤大小與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，本文單獨(dú)測(cè)試結(jié)果與該結(jié)論相一致[12]。CYFRA21-1是一種酸性蛋白質(zhì)，主要存在于肺癌、食管癌等上皮起源的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞溶解或壞死時(shí)可將CYFRA21-1釋放到血液中，研究發(fā)現(xiàn)CYFRA21-1在鱗癌的表達(dá)水平明顯高于腺癌和小細(xì)胞肺癌所以被認(rèn)為是肺鱗癌的最佳診斷標(biāo)志物之一，同時(shí)CYFRA21-1還可敏感地反映腫瘤體積大小的變化，可作為進(jìn)展期肺癌患者化療療效評(píng)價(jià)指標(biāo)以減少對(duì)患者進(jìn)行影像學(xué)檢查[13]。NSE主要在神經(jīng)分泌細(xì)胞與神經(jīng)源腫瘤細(xì)胞中，而肺癌中，小細(xì)胞肺癌屬于神經(jīng)源腫瘤中的一種，因此本文選擇NSE作為診斷指標(biāo)之一，研究數(shù)據(jù)顯示NSE與臨床分期的關(guān)系并不明顯，但與疾病的預(yù)后有著較為密切的關(guān)系[14]。SCC-Ag主要存在與宮頸癌、肺癌、食管癌等多種鱗狀細(xì)胞癌中，具有較高的特異性，有研究者曾將SCC-Ag與CYFRA21-1聯(lián)合檢測(cè)，其對(duì)鱗癌型肺癌患者的陽(yáng)性檢出率達(dá)到100%陽(yáng)性，有利于提高肺癌中鱗癌的診斷[15]。CA125、CA153均是由腺體分泌的上皮黏蛋白，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腺癌中均有較高的表達(dá)，目前作為上皮性卵巢癌與子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)志物，雖然不是診斷肺癌的特異性指標(biāo)，但臨床數(shù)據(jù)顯示肺癌患者體內(nèi)CA153、CA125水平也高于健康人群，可能是因?yàn)镃A153、CA125屬于腫瘤相關(guān)抗原在肺癌組織內(nèi)自行合成與分泌，同時(shí)基膜被病灶侵襲下阻擋作用消失導(dǎo)致抗原進(jìn)入血液，對(duì)不同類型肺癌患者檢測(cè)顯示腺癌患者CA153、CA125值均明顯高于鱗癌與小細(xì)胞肺癌的患者，所以該指標(biāo)對(duì)于腺癌類肺癌的診斷有較高的參考價(jià)值[16]。

各sTM指標(biāo)、miRNAs指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)AUC值為0.828～0.953，聯(lián)合診斷AUC值最大(P<0.05)。各指標(biāo)AUC值均大于0.7，說(shuō)明本文所選擇的各指標(biāo)對(duì)肺癌診斷均有較大的診斷意義，而將sTM與miRNAs聯(lián)合檢測(cè)的AUC面積最大，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于肺癌的診斷效能最高。這可能與單獨(dú)檢測(cè)時(shí)各指標(biāo)所針對(duì)的不同類型的肺癌特異性不同，單一指標(biāo)檢測(cè)的敏感性和特異性不足，導(dǎo)致診斷率不高，將sTM指標(biāo)與miRNAs指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)的不足，提高診斷效能。本文中單一指標(biāo)檢測(cè)對(duì)于肺癌的診斷雖均具有較大的意義，但每個(gè)指標(biāo)所針對(duì)的肺癌類型敏感性不同，難免會(huì)出現(xiàn)漏診而延誤患者的病情，聯(lián)合檢測(cè)可對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)充。

綜上所述，結(jié)合sTM與相關(guān)miRNA 的檢測(cè)有助于發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，提高腫瘤診斷的正確性和特異性，為臨床早期診斷提供更充分的依據(jù)，為肺癌的治療研究提供新的診療策略。