TP53基因在維吾爾族食管癌中的基因表型、蛋白表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性

阿不都沙拉木·阿不都熱合曼 買地尼也提·尼亞孜 張海平 居來(lái)提·艾尼瓦爾 阿不都艾尼·吐爾洪 張力為 伊力亞爾·夏合丁 伊地力斯·阿吾提

[摘要] 目的 探討維吾爾族食管癌組織中TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)狀況及其與預(yù)后的相關(guān)性。 方法 選取2009年12月～2013年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科行根治性手術(shù)切除的維吾爾族食管鱗狀細(xì)胞癌患者67例，應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)其間期細(xì)胞核中TP53基因缺失情況，并通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)p53蛋白表達(dá)情況，分析TP53基因表型、蛋白表達(dá)與臨床病理因素及術(shù)后生存期的關(guān)系。 結(jié)果 在食管癌高分化組中TP53基因的缺失率為15.00%，而在中、低分化組中為40.43%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；而TP53基因缺失在不同腫瘤浸潤(rùn)深度、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)樣本中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。p53蛋白表達(dá)在不同腫瘤分化程度、不同腫瘤浸潤(rùn)深度和不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)樣本中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 TP53基因缺失與食管癌腫瘤分化程度有一定的相關(guān)性，但與術(shù)后生存期關(guān)系不能確定，TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)尚不能作為評(píng)估維吾爾族食管癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，需要增加樣本量進(jìn)一步確定。

[關(guān)鍵詞] 維吾爾族；食管鱗狀細(xì)胞癌；p53；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R739.45 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）06（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study the TP53 gene deletion and p53 protein expression level in Uygur′s esophageal carcinoma， and its correlation with prognosis of Uygur esophageal cancer patients. Methods Sixty-seven cases of Uygur esophageal squamous cell carcinoma treated by radical resection from December 2009 to June 2013 in Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected. TP53 gene deletion and p53 protein expression was detected respectively by fluorescence in situ hybridization and immuno-histo-chemistry methods. The relationship of TP53 gene deletion and p53 protein expression with clinicopathological factors and postoperative survival rate was analyzed. Results In the highly differentiated group， the deletion rate of TP53 gene was 15.00%， which of moderate and poorly differentiation group was 40.43%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference of the deletion rate of TP53 gene in different tumor invasion depth and lymph node metastasis status （P > 0.05）. There was no significant difference of the degree of p53 protein expression in different degrees of tumor differentiation， tumor invasion depth and lymph node metastatis status （P > 0.05）. Conclusion There is a certain correlation between TP53 gene deletion and the differentiation degree of esophageal carcinoma tumor， but the relationship with the survival has not been determined. The TP53 gene deletion and p53 protein expression level cannot be seen as the prognostic biomarkers of Uygur patients with esophageal cancer. Therefore， larger sample capacity is needed for in-depth exploration and determination.

[Key words] Uygur； Squamous cell carcinoma of the esophagus； p53； Prognosis

食管癌是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，中國(guó)是食管癌高發(fā)地，以鱗癌為主[1]。食管癌發(fā)病率和病因?qū)W因素存在著明顯的地域性差異和種族差異[2]，新疆是多民族聚集區(qū)，也是食管癌高發(fā)地區(qū)，維吾爾族是食管癌高發(fā)民族之一[3]。食管癌發(fā)生發(fā)展與多基因、多因素有關(guān)，TP53基因是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，其編碼的野生型p53蛋白控制細(xì)胞周期的啟動(dòng)，防止突變基因出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性和癌變[4]，與人類多數(shù)惡性腫瘤有關(guān)[5]。雖然p53蛋白過(guò)度表達(dá)經(jīng)常被認(rèn)為是一個(gè)對(duì)TP53基因突變的替代，但它與基因序列檢測(cè)結(jié)果具有較高的假陽(yáng)性和假陰性[6]。FISH技術(shù)檢測(cè)出染色體突變和特定基因拷貝數(shù)改變而診斷惡性細(xì)胞的方法[7]，國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)TP53基因缺失與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8-9]。但其在維吾爾族食管癌患者中的表型和表達(dá)鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測(cè)維吾爾族食管癌組織中TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)情況，并分析其在不同分化程度、不同腫瘤浸潤(rùn)深度及不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)樣本中的差異，評(píng)估TP53基因在維吾爾族食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與食管癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2009年12月～2013年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行食管癌根治術(shù)的維吾爾族食管鱗狀細(xì)胞癌患者67例，其中男50例，女17例；根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）第7版標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行病理學(xué)診斷，包括腫瘤分化、腫瘤浸潤(rùn)、腫瘤分期：67例患者中高分化20例，中度分化43例，低分化4例；T1和T2共19例，T3和T4共48例；區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性36例，陰性31例；術(shù)后TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期29例。

術(shù)后組織離體后取新鮮腫瘤組織和癌旁正常組織（距癌組織5 cm以外處）標(biāo)本，新鮮腫瘤組織在載玻片上觸貼式制作FISH檢測(cè)標(biāo)本，浸入10%中性甲醛，按照標(biāo)準(zhǔn)程序石蠟包埋。連續(xù)切片（4 μm）進(jìn)行蘇木精染色、免疫組化檢測(cè)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的書面知情同意。

1.2 FISH方法

應(yīng)用FISH方法檢測(cè)TP53基因缺失突變情況，使用雙色FISH探針即橙色熒光標(biāo)記的LSI TP53探針和綠色熒光標(biāo)記的17號(hào)染色體著絲粒探針（Cytocell Ltd，英國(guó)）。組織芯片在60℃烤片2 h后，將用二甲苯脫蠟和梯度乙醇溶液水化，空氣干燥組織切片。在80℃ Vysis pretreatment solution中孵育15 min。用超純水液洗滌后用Vysis protease Ⅰ溶液，在37℃中孵育10 min，并用超純水洗滌，在冷乙醇溶液脫水（70%、80%、90%、100%各2 min）。滴加10 μL的雜交混合物后蓋上蓋玻片，用橡膠泥密封。用雜交儀變性雜交（變性條件：75℃，5 min；雜交條件：37℃，過(guò)夜）。次日，用（73±1）℃的2×SSC溶液洗滌2 min，再放入同樣緩沖液在室溫下洗滌1 min。

FISH評(píng)分：計(jì)數(shù)100個(gè)有熒光信號(hào)的不重疊細(xì)胞核，根據(jù)信號(hào)改變的細(xì)胞核百分比來(lái)計(jì)算。FISH陽(yáng)性判別標(biāo)準(zhǔn)：正常細(xì)胞有兩個(gè)紅色和綠色信號(hào)，p53的紅色信號(hào)為一個(gè)或零信號(hào)，并且缺失率在30%以上判定為缺失。

1.3 免疫組化染色方法

應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)p53蛋白表達(dá)情況，使用免疫組化Envision法對(duì)所有切片行p53染色標(biāo)記，小鼠抗人p53單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行，一抗?jié)舛?∶100，用0.01 mol/L PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，用已知乳腺癌陽(yáng)性組織切片為陽(yáng)性對(duì)照。由2位病理科醫(yī)師采取雙盲法觀察切片并診斷，結(jié)果一致則記錄結(jié)果，如有爭(zhēng)議，以2個(gè)相同意見(jiàn)為準(zhǔn)。p53蛋白陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)灶≥10%的癌細(xì)胞有明顯的核棕黃色或棕褐色染色，包括一些黏膜的基底細(xì)胞層中≥10%的細(xì)胞有相應(yīng)的p53特征染色為陽(yáng)性。只限于基底細(xì)胞的很弱的染色被認(rèn)為陰性[11]。根據(jù)陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)量與總數(shù)的比例計(jì)算陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)情況

p53蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞核，在67例食管鱗癌組織標(biāo)本中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常食管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。67例患者癌組織中TP53基因缺失率明顯高于癌旁正常食管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

67例食管鱗癌組織標(biāo)本中，TP53基因缺失22例，其中18例p53蛋白陽(yáng)性；TP53基因檢測(cè)未缺失的45例樣本中p53蛋白陰性31例，兩種結(jié)果符合率為73.13%（49/67）。

鏡下可見(jiàn)癌組織p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性與癌旁組織表達(dá)陰性，癌組織TP53基因缺失陽(yáng)性與癌旁組織陰性，見(jiàn)圖1（封四）。

2.2 TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，p53蛋白在不同腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移人群之間的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。TP53基因缺失在不同腫瘤浸潤(rùn)深度、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移人群之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。TP53基因缺失情況在高分化組與中低分化組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

3討論

食管癌是消化道常見(jiàn)腫瘤，手術(shù)切除目前仍是其最主要的治療手段。由于大多患者診斷明確時(shí)已到中晚期，加之術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等因素使食管癌預(yù)后不良[12]。因此，早期診斷、早期治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵因素。食管癌的發(fā)生是多步驟、多階段基因異常累計(jì)結(jié)果，原癌基因激活、抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，TP53是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因之一[13]，TP53基因缺失和突變情況常發(fā)生在食管癌早期階段[14-15]，TP53基因缺失在食管癌的早期診斷中有一定應(yīng)用價(jià)值[16]。

維吾爾族食管癌患者大多數(shù)是癌癥中晚期才診斷明確的，其主要原因是患者出現(xiàn)癥狀時(shí)未及時(shí)到醫(yī)院檢查，其中一半患者在了解胃鏡檢查取病理的重要性以及可以行無(wú)痛胃鏡檢查的前提下，還是會(huì)拒絕行胃鏡檢查，而不能取病理明確診斷，還有部分患者胃鏡取活檢部位不準(zhǔn)確而再次行胃鏡檢查時(shí)被患者拒絕，故本研究希望明確食管癌的早期診斷指標(biāo)。

本研究中食管癌組織中TP53基因缺失率和p53蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁正常食管組織，結(jié)果分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)與食管癌的發(fā)生有密切關(guān)系。p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為47.76%，TP53基因缺失率為32.84%，TP53基因缺失的比率小于蛋白表達(dá)率。這可能是因?yàn)榛蚨喾N突變方式都可引起p53蛋白表達(dá)異常，p53蛋白功能可以通過(guò)突變以外其他機(jī)制失活，此結(jié)果與國(guó)外發(fā)表的相關(guān)研究報(bào)道一致[17]。

p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)與維吾爾族食管癌患者腫瘤分化程度、腫瘤分期與病理分期等臨床病理因素?zé)o相關(guān)性（P > 0.05），國(guó)內(nèi)外有相同的研究結(jié)果[17-19]，也有不同的結(jié)果[20-22]，這可能與人群基因特點(diǎn)、樣本量少、隨機(jī)抽樣誤差等有關(guān)。

TP53基因缺失情況與腫瘤分化程度有關(guān)，高分化組中TP53基因缺失率為15.00%，在中、低分化組中為40.43%，分化程度低者，TP53基因缺失陽(yáng)性率高（P < 0.05）。分化程度是影響食管癌預(yù)后的因素之一，TP53基因缺失情況與分化程度的關(guān)系提示其可能影響患者預(yù)后，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步進(jìn)行分析。

綜上，本研究結(jié)果顯示TP53基因缺失與食管癌腫瘤分化程度有一定的相關(guān)性，但與術(shù)后生存期關(guān)系不能確定，TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)尚不能作為評(píng)估維吾爾族食管癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，TP53基因缺失和p53蛋白表達(dá)在維吾爾族食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 赫捷，邵康.中國(guó)食管癌流行病學(xué)現(xiàn)狀、診療現(xiàn)狀及未來(lái)對(duì)策[J].中國(guó)癌癥雜志，2011，21（7）：501-504.

[2] Lu XM，Zhang YM，Lin RY，et al. Relationship between genetic polymorphisms of metabolizing enzymes CYP2E1，GSTM1 and Kazakh's esophageal squamous cell cancer in Xinjiang，China [J]. World J Gastroenterol，2005，11（24）：3651-3654.

[3] 居來(lái)提·艾尼瓦爾，李德生，張力為，等.新疆2005～2008年伊犁地區(qū)食管癌患病情況調(diào)查研究[J].新疆醫(yī)學(xué)，2011， 41（10）：112-114.

[4] Ko LJ，Prives C. p53：Puzzle and paradigm [J]. Genes Dev，1996，10（9）：1054-1072.

[5] Schmale H，Bamberger C. A novel protein with strong homology to the tumor suppressor p53 [J]. Oncogene，1997， 15（11）：1363-1367.

[6] Hamelin R，F(xiàn)léjou JF，Muzeau F，et al. TP53 gene mutations and p53 protein immunoreactivity in malignant and premalignant Barrett's esophagus [J]. Gastroenterology，1994，107（4）：1012-1018.

[7] Brankley SM，F(xiàn)ritcher EG，Smyrk TC. Fluorescence in situ hybridization mapping of esophagectomy specimens from patients with Barrett's esophagus with high-grade dysplasia or adenocarcinoma [J]. Hum Pathol，2012，43（2）：172-179.

[8] LI Weijiang，Duan Jinxia. Detecting of p53 gene heterozygosity loss in esophageal carcinoma tissues [J]. Journal of Zhengzhou University（Medical Sciences），2004，39（3）：499-501.

[9] Rice TW，Blackstone EH，Rusch VW. 7th Edition of the AJCC Cancer Staging Manual：Esophagus and Esophagogastric Junction [J]. Ann Surg Oncol，2010，17（7）：1721-1724.

[10] Hollstein MC，Metcalf RA，Welsh JA，et al. Frequent mutation of the p53 gene in human esophageal cancer [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87（24）：9958-9961.

[11] Fagundes RB，Melo CR，Pütten ACK，et al. p53 immunoexpres-sion：an aid to conventional methods in the screening of precursor lesions of squamous esophageal cancer in patients at high-risk？ [J]. Cancer Detect Prev，2005，29（3）：227-232.

[12] Ando N，Kato H，Igaki H，et al. A Randomized Trial Comparing Postoperative Adjuvant Chemotherapy with Cisplatin and 5-Fluorouracil Versus Preoperative Chemotherapy for Localized Advanced Squamous Cell Carcinoma of the Thoracic Esophagus（JCOG9907）[J]. Ann Surg Oncol，2012，19（1）：68-74.

[13] O'Connor PM，Jackman J，Jondle D，et al. Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines [J]. Cancer Research，1993，53（20）：4776-4780.

[14] Gao H，Wang LD，Zhou Q，et al. p53 tumor suppressor gene mutation in early esophageal precancerous lesions and carcinoma among high-risk populations in Henan，China [J]. Cancer Res，1994，54（16）：4342-4346.

[15] 陳新，平育敏，白世祥，等. p16和p53在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用腫瘤雜志，2004，19（1）：23-27.

[16] Reid BJ，Prevo LJ，Galipeau PC，et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus Ⅱ：baseline 17p（p53）loss of heterozygosity identifies a patient subset at increased risk for neoplastic progression [J]. Am J Gastro，2001，96（10）：2839-2848.

[17] Coggi G，Bosari S，Roncalli M，et al. p53 protein accumulation and p53 gene mutation in esophageal carcinoma [J]. Cancer，1997，79（3）：425-432.

[18] Sarbia M，Porschen R，Borchard F，et al. p53 protein expression and prognosis in squamous cell carcinoma of the esophagus [J]. Cancer，1994，74（8）：2218-2223.

[19] Inada S，Koto T，F(xiàn)utami K，et al. Evaluation of malignancy and the prognosis of esophageal cancer based on an immunohistochemical study（p53，E-cadherin，epidermal growth factor receptor）[J]. Surgery Today，1999，29（6）：493-503.

[20] 楊宣琴，王全紅，李光.食管鱗狀細(xì)胞癌p53基因雜合性缺失和基因突變的相關(guān)研究[J].腫瘤研究與臨床，2006，18（2）：92-94.

[21] 廖瓊，郭玉萍，楊素瓊，等.食管鱗狀細(xì)胞癌P53蛋白表達(dá)和基因突變與預(yù)后的關(guān)系[J].四川醫(yī)學(xué)，2004，25（1）：103-105.

[22] 陳旭峰，呂桂泉，曹巍，等.食管鱗狀細(xì)胞癌中p53基因變異的臨床意義及地域性差別[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，1999， 79（11）：841-843.