糖尿病大鼠腸道甜味受體表達(dá)及腸促胰素分泌的變化

錢程 馮日露 吳斌 麻靜

[摘要] 目的 觀察糖尿病大鼠回腸甜味受體（STRs）表達(dá)及胃腸激素分泌的變化。 方法 選取健康對照組（CON組）SD大鼠、Zucker肥胖糖尿病大鼠（ZDF組）和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠（STZ組），每組各7只。三組大鼠均行胃內(nèi)葡萄糖耐量實驗，期間采集血樣測量血糖，分離血漿檢測胰島素和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）濃度。1周后，處死大鼠取回腸組織采用RT-PCR檢測STRs的表達(dá)。 結(jié)果 與CON組和STZ組比較，ZDF組回腸T1R3及α-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素表達(dá)均下調(diào)（P < 0.05）。在0、15、30、60、120 min時，STZ組血糖水平高于CON組及ZDF組（P < 0.01）。在0、15、30、60、120 min時，ZDF組血清胰島素和GLP-1水平高于CON組及STZ組大鼠（P < 0.05，P < 0.01）。 結(jié)論 ZDF大鼠回腸T1R3及其下游信號分子表達(dá)失調(diào)，腸道STRs表達(dá)可能與葡萄糖代謝有關(guān)，其機制仍需要進一步研究。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病；回腸；甜味受體；胰高血糖素樣肽-1

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（b）-0007-05

[Abstract] Objective To observe the expression of sweet taste receptors （STRs） and downstream molecules in the ileum and gut hormone secretion in diabetic rats. Methods SD rats （CON group）， zucker diabetic fatty （ZDF group） rats and STZ-induced diabetic rats （STZ group） were involved in this study （n = 7）. The rats in each group were received an intragastric glucose tolerance test. Blood samples were taken for measurement of blood glucose， plasma insulin and GLP-1 concentrations. One week later， small intestinal tissue was collected and expression of STRs was detected by RT-PCR. Results T1R3 and α-gustducin in the ileum of ZDF group were down-regulated than those of CON and STZ group （P < 0.05）. Fasting and postprandial glucose concentrations in STZ group were higher than CON and ZDF group at 0， 15， 30， 60， 120 min （P < 0.01）. Fasting and postprandial plasma insulin and GLP-1 levels were higher in ZDF group than CON and STZ group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion The ileum expression of T1R3 and its downstream signaling molecules is disordered in ZDF rats， indicating that the expression of intestinal STRs is related to glucose metabolism. The mechanism underneath it still needs further investigation.

[Key words] Diabetes； Ileum； Sweet taste receptor； Glucagon-like peptide-1

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）由腸道L細(xì)胞分泌，L細(xì)胞密集分布于回腸。GLP-1受體激動劑如艾塞那肽和利拉魯肽已經(jīng)用于臨床治療[1-2]，但是在糖尿病狀態(tài)下GLP-1分泌的變化，特別是1型糖尿病仍無定論。明確口腔的甜味感受系統(tǒng)至今已數(shù)十年[3]，由T1R家族的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCR）感知，其中T1R2和T1R3受體異二聚體為主要的STRs。T1R2/T1R3，與α-味轉(zhuǎn)導(dǎo)素（α-gustducin）相結(jié)合，然后與受體電位陽離子通道5（transient receptor potential channel，superfamily M，member5，TRPM5）偶聯(lián)從而發(fā)揮作用[4-5]。近期研究顯示腸道STRs及下游信號分子與分泌GLP-1的L細(xì)胞共表達(dá)[6]。本研究旨在觀察糖尿病大鼠回腸甜味分子表達(dá)以及腸道激素分泌的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

7周齡健康雄性SD大鼠，體重為300～330 g，SPF級，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心斯萊克公司，實驗動物質(zhì)量合格證號為SCXK（滬）2007-0005。ZDF大鼠購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號為SCXK（京）2012-0001。在SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度20～23℃，濕度40%～60%，每日光照12 h，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑和儀器

飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司）；鏈脲佐菌素（Sigma公司，批號：S01301）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（TAKARA公司，批號：AK6201）；SYBR Premix Ex TagTM（TAKARA公司，批號：AK8302）；Trizol（Invitrogen公司，批號：39602）；DEPC處理水（上海翊圣生物科技有限公司，批號：D67460）；GLP-1 ELISA試劑盒和胰島素ELISA試劑盒（Crystal Chem公司）。血糖儀（Roche公司）；低溫離心機（Eppendorf公司）；實時熒光定量PCR儀（ROCHE公司）；NanoDrop 2000c超微量分光光度計（Thermo Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立及分組 SD大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)1周后，尾靜脈測定血糖，血糖未見異常，予以大劑量（30 mg/kg）鏈脲佐菌素腹腔注射，1周后，禁食3 h，血糖>16.7 mmol/L的大鼠視為1型糖尿病模型建模成功，選取7只作為1型糖尿病組（STZ組）。而SD大鼠和ZDF大鼠各7只，分別作為健康對照組（CON組）和2型糖尿病組（ZDF組）。CON組和STZ組大鼠以10%脂肪，22%蛋白質(zhì)和68%碳水化合物的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)；ZDF組大鼠以16.7%脂肪，26.8%蛋白質(zhì)和56.5%碳水化合物組成的誘導(dǎo)食物（Purina#5008）喂養(yǎng)。

1.3.2 胃內(nèi)葡萄糖耐量試驗 喂食4周后，三組大鼠年齡12周。禁食16 h后，將每只大鼠進行葡萄糖溶液灌胃（2 g葡萄糖/ kg體質(zhì)量）。在灌胃前和灌胃后15、30、60、120 min時，用血糖儀測定血糖。在每個時間點從眼窩靜脈叢采集血樣，每個樣品0.5 mL體積，并以3000 r/m離心10 min（離心半徑=8.5 cm）。收集血漿用于檢測胰島素和總GLP-1濃度。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血漿胰島素濃度和血清總GLP-1濃度 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定血漿胰島素濃度，定量檢測批間變異系數(shù)為2.77%。用ELISA試劑盒測定大鼠血漿中的總GLP-1濃度，定量檢測批間變異系數(shù)為4.96%。沒有檢測到與大鼠NPY、GLP-1（7-36）、GLP-1（1-37）和GLP-2有交叉反應(yīng)性。操作步驟參照試劑盒說明書操作。

1.3.4 解剖及樣本采集 IGGTT 1周后，大鼠腹腔注射水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉后放血處死。腹部切口后，將胃到肛門的整個消化道取出。從小腸中取得回腸段（靠近回盲部1～2 cm）。腸段約300 mg的組織用于實時PCR分析。所有樣品都儲存在-80℃的組織管中，以便進一步分析。

1.3.5 相對定量實時聚合酶鏈反應(yīng)的基因表達(dá)（Real-time PCR） 采用酚-氯仿法提取組織內(nèi)總RNA[7]，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用引物5.0軟件設(shè)計T1R2、T1R3、TRPM5、α-gustiducin和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物，具體序列見表1。使用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒于熒光定量PCR擴增儀中進行進行擴增分析。使用2-△△CT方法對目的基因的表達(dá)進行計算分析[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甜味分子

三組大鼠回腸T1R2 mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與CON組比較，ZDF組T1R3、α-gustducin和TRPM5表達(dá)水平顯著降低（P < 0.05）。ZDF組回腸T1R3和α-gustducin的表達(dá)水平低于STZ組（P < 0.05）。見圖1。

2.2 血糖濃度

在禁食狀態(tài)下，STZ組血糖水平高于CON組和ZDF組（P < 0.01）。葡萄糖灌胃后，三組大鼠血糖均有升高（t = 15 min），但呈現(xiàn)不同的時間依賴性。在t = 15 min時CON組出現(xiàn)峰值，而STZ組和ZDF組出現(xiàn)在t = 60 min時。在t = 15、30、60、120 min時，STZ組血糖水平顯著高于另外兩組（P < 0.01）。在t = 30、60、120 min時，ZDF組血糖顯著高于CON組（P < 0.01）。見圖2。

2.3 血胰島素濃度

CON組和ZDF組血漿胰島素水平有組×?xí)r間效應(yīng)（P < 0.05）。ZDF組空腹血漿胰島素濃度高于CON組和STZ組（P < 0.01）。葡萄糖負(fù)荷后，ZDF組及CON組血漿胰島素明顯升高。在t = 15、30、60、120 min時，ZDF組血漿胰島素水平顯著高于CON組和STZ組（P < 0.01）。在t = 15、30、60、120 min時，STZ組血漿胰島素水平明顯低于CON組（P < 0.01）。見圖3。

2.4 血GLP-1濃度

血漿GLP-1濃度有顯著的組×?xí)r間效應(yīng)（P < 0.01）。ZDF組空腹血清GLP-1濃度顯著高于CON組和STZ組（P < 0.01）。葡萄糖負(fù)荷后，三組在t = 15 min時血漿GLP-1水平明顯增加。在t = 15、30、60、120 min時，ZDF組血漿GLP-1水平顯著高于CON組和ZDF組（P < 0.05或P < 0.01）。STZ組與CON組空腹及葡萄糖負(fù)荷后血漿GLP-1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

本研究明確了1型及2型糖尿病大鼠回腸甜味受體表達(dá)及GLP-1分泌的變化。兩種大鼠回腸甜味受體T1R3、a-gustducin和TRPM5的表達(dá)顯著減少。1型糖尿病大鼠GLP-1分泌沒有降低，2型糖尿病大鼠GLP-1空腹及餐后水平均有增高。

GLP-1受體激動劑廣泛運用于臨床降血糖治療，但高血糖對于GLP-1分泌的影響研究結(jié)果仍不一致。目前的研究提示2型糖尿病時血清GLP-1存在不變、降低或增加等不同結(jié)果[9-15]。ZDF大鼠是具有胰島素抵抗特點的2型糖尿病動物模型。本研究顯示，ZDF大鼠空腹和葡萄糖負(fù)荷后，血GLP-1水平顯著高于CON組。GLP-1的分泌主要取決于胃排空速度及營養(yǎng)物質(zhì)在小腸停留時長和部位。據(jù)報道ZDF大鼠胃排空速度明顯加快[16]，可能與ZDF大鼠餐后GLP-1升高有關(guān)。餐后高GLP-1水平也可導(dǎo)致空腹GLP-1高水平[17]。然而，1型糖尿病GLP-1分泌的變化研究不足，在本研究中1型糖尿病大鼠GLP-1分泌并未減少。由此可見，GLP-1受損在1型糖尿病病理機制中作用有限。

盡管甜味信號通路在GLP-1分泌中的作用仍存在爭議，但是T1R3或α-gustducin敲除小鼠GLP-1分泌缺失及血糖升高[18-19]。十二指腸甜味受體表達(dá)受到腸腔葡萄糖濃度和血糖濃度的調(diào)節(jié)[20-21]，而這一調(diào)節(jié)在2型糖尿病患者中受損[20]。本研究在ZDF腸道STRs表達(dá)的基礎(chǔ)上[21]，進一步探索了STZ大鼠在GLP-1分泌細(xì)胞分布較多的回腸甜味受體的表達(dá)。禁食狀態(tài)，ZDF及STZ大鼠回腸T1R3、α-gustducin和TRPM5的表達(dá)水平均有下調(diào)。既往研究提示，T1R3基因敲除的小鼠會出現(xiàn)胰島素敏感性減低和葡萄糖耐受不良的情況[22]。由于在葡萄糖灌胃中，取回腸組織有一定的技術(shù)難度，雖然未體現(xiàn)進餐過程中回腸甜味受體表達(dá)的改變，仍然揭示了1型及2型糖尿病大鼠腸道甜味受體表達(dá)及差異。甜味受體在糖代謝異常狀態(tài)表達(dá)改變的機制仍需進一步研究。

本研究顯示糖尿病大鼠回腸T1R3及下游信號分子的表達(dá)受損，為明確甜味受體及下游信號分子在糖尿病發(fā)病機制的作用提供了初步的證據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Diamant M，Gaal L，Guerci B，et al. Exenatide once weekly versus insulin glargine for type 2 diabetes （DURATION-3）：3-year results of an open-label randomised trial [J]. Lancet Diabetes Endocrinol，2014，2（6）：464-473.

[2] Dungan KM，Povedano ST，F(xiàn)orst T，et al. Once-weekly dulaglutide versus once-daily liraglutide in metformin-treated patients with type 2 diabetes（AWARD-6）：a randomised，open-label，phase 3，non-inferiority trial [J]. Lancet，2014，384（9951）：1349-1357.

[3] Yamamoto K，Ishimaru Y. Oral and extra-oral taste perception [J]. Semin Cell Dev Biol，2013，24（3）：240-246.

[4] Daly K，Al-Rammahi M，Arora DK，et al. Expression of sweet receptor components in equine small intestine：relevance to intestinal glucose transport [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2012，303（2）：R199-208.

[5] Neiers F，Canivenc-Lavier MC，Briand L. What does diabetes "taste" like？[J]. Current Diabetes Reports，2016，16（6）：1-7.

[6] Chen Y，Li ZY，Yang Y，et al. Uncoupling protein 2 regulates glucagon-like peptide-1 secretion in L-cells [J]. World J Gastroenterol，2012，18（26）：3451-3457.

[7] Hudlow WR. NucleoSpin XS columns for DNA concentration and clean-up [J]. Methods Mol Biol，2016，1420：125-129.

[8] Bolha L，Duani D，Narat M，et al. Comparison of methods for relative quantification of gene expression using real-time PCR [J]. Acta Agriculturae Slovenica，2014，100（2）：97-106.

[9] Brown RJ，Walter M，Rother KI. Effects of diet soda on gut hormones in youths with diabetes [J]. Diabetes Care，2012， 35（5）：959-964.

[10] Jorgensen NB，Jacobsen SH，Dirksen C，et al. Acute and long-term effects of Roux-en-Y gastric bypass on glucose metabolism in subjects with type 2 diabetes and normal glucose tolerance [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2012，303（1）：E122-131.

[11] Steinert RE，F(xiàn)einle-Bisset C，Asarian L，et al. Ghrelin，CCK，GLP-1，and PYY（3-36）：secretory controls and physiological roles in eating and glycemia in health，obesity，and after RYGB [J]. Physiol Rev，2017，97（1）：411-463.

[12] Shimoda M，Miyoshi-Takai M，Irie S，et al. Inadequate triglyceride management worsens the durability of dipeptidyl peptidase-4 inhibitor in subjects with type 2 diabetes mellitus [J]. J Diabetes Res，2017，2017（23）：5 856 475.

[13] Chakravarty S，Kalita J. Role of the incretins in hypoglycemic effect of phlogacanthus thyrsiflorus nees in chemically induced diabetic mice [J]. Int J Pharm Sci Res，2016，7（2）：646-659.

[14] Lewis HB，Ahern AL，Solis-Trapala I，et al. Effect of reducing portion size at a compulsory meal on later energy intake，gut hormones，and appetite in overweight adults [J]. Obesity（Silver Spring），2015，23（7）：1362-1370.

[15] Nauck M，Meier J. Incretin hormones：their role in health and disease [J]. Diabetes Obes Metab，2018，20（S1）：5-21.

[16] Muangchan N，Kooptiwut S，Tapechum S，et al. 13C-acetic acid breath test monitoring of gastric emptying during disease progression in diabetic rats [J]. Biol Pharm Bull，2017，40（9）：1506-1514.

[17] Shah P，Rahman SA，Demirbilek H，et al. Hyperinsulinaemic hypoglycaemia in children and adults [J]. Lancet Diabetes Endocrinol，2017，5（9）：729-742.

[18] Murovets VO，Bachmanov AA，Zolotarev VA. Impaired glucose metabolism in mice lacking the Tas1r3 taste receptor gene [J]. PLoS One，2015，10（6）：e0 130 997.

[19] Jang HJ，Kokrashvili Z，Theodorakis MJ，et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（38）：15 069-15 074.

[20] Young RL，Chia B，Isaacs NJ，et al. Disordered control of intestinal sweet taste receptor expression and glucose absorption in type 2 diabetes [J]. Diabetes，2013，62（10）：3532-3541.

[21] Feng R，Qian C，Liu Q，et al. Expression of sweet taste receptor and gut hormone secretion in modelled type 2 diabetes [J]. Gen Comp Endocrinol，2017，252：142-149.

[22] Kokrashvili Z，Mosinger B，Margolskee RF. T1r3 and alpha-gustducin in gut regulate secretion of glucagon-like peptide-1 [J]. Ann N Y Acad Sci，2009，1170（1）：91-94.