索拉非尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷治療急性髓細(xì)胞白血病療效及對(duì)患者干細(xì)胞NF-κB及FLT3蛋白表達(dá)影響

于 婷， 鄭 立,袁 穎

四川省廣元市中心醫(yī)院血液內(nèi)科(廣元 628000)

主題詞 白血病, 髓樣, 急性/治療 @索拉非尼 阿糖胞苷 @蛋白表達(dá)

急性髓細(xì)胞白血病 (Acute myeloid leukemia,AML)是髓系造血干細(xì)胞的克隆增殖導(dǎo)致的造血功能受損繼而出現(xiàn)白血病細(xì)胞器官浸潤(rùn)、粒細(xì)胞缺乏等惡性血液腫瘤。AML在35歲以上成人中發(fā)病率最高[1]，病死率占癌癥死亡的1.6%[2],隨著腫瘤靶向治療技術(shù)的不斷提高，抑制AML異常突變基因治療研究逐漸增多，F(xiàn)LT3基因突變是AML最常見(jiàn)的基因突變，F(xiàn)LT3基因突變的陽(yáng)性表達(dá)常預(yù)示預(yù)后不良[3]，NF-κB是一類參與炎癥、免疫、應(yīng)激、腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)行為中基因調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。索拉非尼是首個(gè)口服多靶點(diǎn)激酶抑制劑, 具有多靶點(diǎn)控制、廣譜、易于聯(lián)合用藥，患者耐受性好等優(yōu)點(diǎn)[4]，聯(lián)合化療在治療難治性和移植后復(fù)發(fā)的AML有較大的優(yōu)勢(shì)[5]。目前關(guān)于索拉菲尼聯(lián)合化療對(duì)FLT3、NF-κB表達(dá)的研究較少，此背景下，對(duì)我科62例AML患者采用索拉菲尼聯(lián)合小劑量Ara-C治療，觀察臨床療效以及對(duì)FLT3、NF-κB表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

資料與方法

1 一般資料 選取2016年1月至2017年2月我院血液科收治的62例經(jīng)AML患者。復(fù)發(fā)難治性AML診斷依據(jù)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)修訂的AML中國(guó)診療指南(2011年版)。AML患者形態(tài)學(xué)分型參考FAB分型。所有患者均經(jīng)我院細(xì)胞遺傳學(xué)、骨髓形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)(MICM)、免疫學(xué)等檢測(cè)[6]確診。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為兩組，每組31例，研究組男16例，女15例，年齡(36.82±6.97)歲，BMI(23.58±4.25)Kg/m2，F(xiàn)AB分型：M1型7例，M2型15例， M4型4例，M5型5例，初診16例，復(fù)發(fā)15例；對(duì)照組男18例，女13例，年齡(37.26±7.05)歲，BMI(24.97±4.08)Kg/m2，F(xiàn)AB分型：M1型6例，M2型13例， M4型6例，M5型6例，初診14例，復(fù)發(fā)17例；兩組基線有可比性(P>0.05)。

2 方 法

2.1 治療方法：研究組患者于進(jìn)食前1 h或進(jìn)食后2 h口服索拉非尼片(德國(guó)拜耳)400 mg，2次/d，連續(xù)服用35 d，治療過(guò)程中患者若出現(xiàn)不耐受可降低服用次數(shù)至1次/d或隔日一次;阿糖胞苷注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20055128)50 mg皮下注射,治療14 d。對(duì)照組采用DA誘導(dǎo)化療方案：柔紅霉素(20 mg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020925)60 mg溶于250 ml的0.9%NaCl溶液中快速靜點(diǎn)，1次/d,連續(xù)用藥3 d，Ara-C200 mg溶于500 ml 5%GS溶液中緩慢靜滴，連續(xù)用藥7 d。

2.2 副作用觀察及支持治療：每日5%NaHCO2250 ml靜脈滴注堿化尿液,阿扎司瓊注射液2 ml化療前后靜脈注射預(yù)防嘔吐，強(qiáng)水化治療(每日靜脈液體入量2500～3000 ml/m2)。中性粒細(xì)胞缺乏(ANC<0.5×109/L[7])時(shí)入住層流病室，每日皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子150～300 μg,無(wú)菌飲食，并加強(qiáng)口腔、鼻腔、外耳道、皮膚護(hù)理和肛周護(hù)理及中心靜脈置管護(hù)理。每3 d檢查一次血常規(guī)，如Hb<60 g/L，給予輸注紅細(xì)胞懸液，若Plt<20×109/L 時(shí)，給予輸注單采血小板懸液。當(dāng)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞缺乏或發(fā)熱時(shí)，給予抗感染治療，參照2012年中國(guó)中性粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者抗菌藥物臨床應(yīng)用指南[8]，抗真菌治療參考 2013 年血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則[9]。

2.3 NF-κB檢測(cè)方法：所有患者均于治療前后采集骨髓5 ml，置入抗凝試管，PBS液洗滌，應(yīng)用免疫磁珠分選系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行白血病干細(xì)胞的分選和純化。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞48 h，Western Bloting法檢測(cè)NK-κB的表達(dá)。

2.4 FLT3基因檢測(cè)方法：采用多聚酶鏈反應(yīng)PCR+單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCP方法患者治療前、后新鮮骨髓中的FLT3基因及FLT3-ITD基因突變。所有患者均于治療前、后采集骨髓5 ml，置入抗凝試管，PBS液洗滌，應(yīng)用免疫磁珠分選系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行白血病干細(xì)胞的分選和純化。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞48 h。總DNA使用全血基因組提取試劑盒進(jìn)行提取，并測(cè)定A260/A280，判斷DNA的濃度和純度。采用去離子水稀釋終樣品至500 ng/μl，備用。根據(jù)FLT3突變區(qū)的一般情況，將檢測(cè)上游引物、下游引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別設(shè)計(jì)為5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’、5’-CTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’及329bp。采用PCR試劑盒，20 pmol/μl上下游引物+500 ng基因組DNA，去離子水定容至50 μl。經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)的預(yù)變性、變性、退火、延伸過(guò)程，取15 μl反應(yīng)產(chǎn)物，運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析。

3 觀察指標(biāo) 療效評(píng)價(jià)：治療結(jié)束2周進(jìn)行骨髓穿刺復(fù)查骨髓細(xì)胞形態(tài)，參照血液病學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[10]，CR：未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)所致的癥狀和體征;Hb≥100 g/L(男)或Hb≥90 g/L(女及兒童)，ANC≥1.5×109g/L，血小板≥100×109g/L，外周血未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞；原粒細(xì)胞Ⅰ型 +Ⅱ型、原始細(xì)胞+幼稚單核細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞≤5%，紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞系正常。PR:5%<骨髓原粒細(xì)胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始單核+幼稚單核細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞)≤20%，臨床、外周血象中有一項(xiàng)未達(dá)完全緩解者。NR：骨髓原粒細(xì)胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始單核+幼稚單核細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞)>20%，臨床癥狀未改善，外周血仍存在白血病細(xì)胞。安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)：依據(jù)WHO急性及亞急性化療藥物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定不良反應(yīng)，0(無(wú))、Ⅰ(輕度)、Ⅱ(中度)、Ⅲ(重度)、Ⅳ(威脅患者生命)。

結(jié) 果

1 療效評(píng)價(jià) 研究組22例CR，7例PR，2例未緩解，對(duì)照組16例CR，9例PR，6例未緩解。兩組PR例數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組CR比例高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；研究組NR比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2 安全性評(píng)價(jià) 研究組2例中性粒細(xì)胞缺乏，1例血小板減少、1例貧血、1例消化道不良反應(yīng)、2例感染，均為Ⅰ-Ⅱ級(jí)不良反應(yīng)，不良反應(yīng)率22.58%，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且研究組粒缺時(shí)間(12.94±2.17)d，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

3 FLT3、NK-κB在不同治療組治療前后的差異 兩組FLT3、NK-κB在治療前表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)，研究組治療后FLT3、NK-κB的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)，表達(dá)強(qiáng)度低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 兩組療效評(píng)價(jià)[例(%)]

表2 兩組安全性評(píng)價(jià)

表3 不同治療組治療前后FLT3、NK-κB表達(dá)的差異

討 論

FLT3是對(duì)造血免疫系統(tǒng)具有重要意義的受體絡(luò)氨酸激酶，在正常造血系統(tǒng)表達(dá)于早期造血祖細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和大腦、胎盤(pán)等組織，過(guò)度表達(dá)于AML的各個(gè)FAB分型，以及B細(xì)胞ALL和部分T細(xì)胞ALL。35%AML患者存在FLT3基因突變，F(xiàn)LT3+患者對(duì)常規(guī)化療不敏感，療效差，誘導(dǎo)化療緩解率低、緩解維持時(shí)間短、極易復(fù)發(fā)，部分接受異體造血干細(xì)胞移植后仍可出現(xiàn)復(fù)發(fā)，F(xiàn)LT3基因突變常提示預(yù)后不良。

索菲拉尼是一種小分子、多靶點(diǎn)多激酶抑制劑，對(duì)存在細(xì)胞內(nèi)和表面的Raf激酶、VEGFR-2、VEGFR-3等可顯著抑制，阻斷腫瘤新生血管的形成間接抑制腫瘤，同時(shí)索菲拉尼還可以通過(guò)抑制RAF等信號(hào)通路直接抑制腫瘤生長(zhǎng)。索菲拉尼最初用于腎癌、肝癌的治療。本研究組患者采用索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷治療AML初治和復(fù)發(fā)患者完全緩解22例，CR率70.97%，且在誘導(dǎo)化療期間不良反應(yīng)少，雖然中性粒細(xì)胞缺乏發(fā)生率較高，但是明顯低于對(duì)照組，且中性粒細(xì)胞缺乏時(shí)間明顯短于對(duì)照組，其它不良反應(yīng)均為骨髓抑制和消化道副作用，且不良反應(yīng)分級(jí)均為Ⅰ-Ⅱ級(jí)，不良反應(yīng)率22.58%，總體低于對(duì)照組。可能與研究組方案減少了阿糖胞苷使用劑量從而降低骨髓抑制程度有關(guān)。索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷不僅可以提高臨床緩解率，而且可以降低不良反應(yīng)，提高患者治療耐受度，增強(qiáng)治療效果。其次我們研究了不同治療方案對(duì)AML患者FLT-3以及NK-κB表達(dá)的影響，可以看出兩組治療后FLT-3、NK-κB表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，證明兩種化療方案均對(duì)FLT-3、NK-κB表達(dá)都可產(chǎn)生一定的影響，但索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷對(duì)FLT-3、NK-κB表達(dá)的影響程度更大，研究組方案對(duì)FLT-3基因突變AML患者治療效果優(yōu)于對(duì)照組，同時(shí)也提示我們索菲拉尼可能通過(guò)抑制FLT-3基因表達(dá)抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的機(jī)制。綜上，聯(lián)合索菲拉尼和小劑量阿糖胞苷治療可明顯降低FLT3基因的表達(dá)，提高AML臨床緩解率高，且對(duì)復(fù)發(fā)AML患者有效。