Box—Behnken響應面法優化青龍衣中胡桃醌提取工藝

王麗紅 閆勇杰 趙宏 宗希明 張云杰

摘要：目的 對青龍衣中胡桃醌的提取工藝進行優化。方法 在單因素試驗基礎上，選取料液比、超聲提取溫度和乙醇濃度為自變量，胡桃醌得率為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用響應面法對青龍衣中胡桃醌的提取工藝進行優化。結果 胡桃醌最佳提取工藝為14.30倍量89.81%乙醇，30.28 ℃恒溫提取。胡桃醌得率為2.034 mg/g，與實測值1.957 mg/g偏差較小。結論 優選的提取工藝合理可行，可為提取青龍衣中的胡桃醌提供依據。

關鍵詞：青龍衣；Box-Behnken響應面法；核桃楸；胡桃醌；提取工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.016

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0067-04

Abstract： Objective To optimize extraction process of walnut quinone from Juglans green peel. Methods On the basis of single factor tests， taking material-liquid ratio， extracting temperature and ethanol concentration as independent variables， yield of walnut quinone in response to as a value， according to Box-Behnken experiment design principle， extraction process of walnut quinone from Juglans green peel was optimized by response surface analysis. Results The optimum extraction process of walnut quinone was： 14.30 times the amount of 89.81% ethanol； 30.28 ℃ constant temperature. The extracting amount of walnut quinone was 2.034 mg/g， which was close to the experimental results of 1.957 mg/g. Conclusion The optimized extraction process is reasonable and feasible， which can provide reference for the extraction of walnut quinone from Juglans green peel.

Keywords： Juglans green peel； Box-Behnken response surface methodology； Juglans mandshurica； walnut quinone； extraction process

核桃楸Juglans mandshurica Maxim.又名胡桃楸，為胡桃科胡桃屬落葉喬木，是我國珍貴木材樹種[1]。核桃楸樹皮、枝皮和果皮均可入藥，其未成熟外果皮又稱青龍衣?！吨腥A本草》記載青龍衣“氣微，味微苦、澀。清熱燥濕，泄肝明目。主治濕熱下痢，帶下黃稠，目赤腫痛，麥粒腫，迎風流淚，骨結核”[2]。青龍衣具有清熱、解毒、鎮痛、抗腫瘤等功效[3]，主要含有多糖類、醌類、黃酮類及大量鞣質等化學成分，胡桃醌為青龍衣抗腫瘤的主要成分。1973年，Ota A等[4]從野核桃新鮮青皮中分離提純出5，8-二羥基-l，4萘醌，得出青龍衣中存在萘醌的結論，至今萘醌及其衍生物已成為各地學者的研究重點[5]。

國內已有學者采用HPLC和紫外分光光度法對核桃楸青果皮、樹皮和樹葉中胡桃醌提取工藝進行研究，試驗方法均為單因素和正交試驗[6-9]。由于未對單因素選擇進行優化且考察因素較少、正交試驗只能處理離散型數據等缺陷，得出的提取工藝中各因素水平數值不夠精確。本研究在單因素試驗優化基礎上，通過Box-Behnken響應面分析法優選青龍衣中胡桃醌的最優提取工藝。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series HPLC色譜儀（美國安捷倫公司），BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司），FA2004電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司），KQ-250DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），80-2臺式低速離心機（上海亞榮生化儀器廠），SHB-III循環水式多用真空泵（鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司）。

胡桃醌對照品（純度≥98%，河南省標物生物科技有限公司，批號16081201），色譜純甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司），其余試劑均為分析純。

試驗用材料于2016年9月21日采自黑龍江省湯原縣鷹山，經佳木斯大學王麗紅教授鑒定為胡桃科胡桃屬核桃楸Juglans mandshurica Maxim.的果實，果皮剝下后陰干[10]，粉碎后過孔徑0.25 mm網篩，備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 測定波長

取胡桃醌對照品溶液適量，用紫外分光光度計在波長0～800 nm掃描，得248 nm為胡桃醌紫外最大吸收波長，故選擇該波長為測定波長。

2.1.2 分離條件

依據文獻[11]，HPLC測定胡桃醌含量時，流動相為甲醇-水（55∶45）且水相用磷酸（約0.1%）調pH值為3.30～3.80時胡桃醌分離峰形最佳。

2.1.3 色譜條件的確定

采用Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（55∶45），水相用磷酸（約0.1%）調pH值為3.60，流速為1 mL/min，檢測波長248 nm，柱溫為室溫，進樣量10 μL[12]。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

準確稱取胡桃醌對照品5.09 mg，用甲醇定容到25 mL容量瓶中，得胡桃醌對照品母液。精密移取該對照品母液0.25、0.5、1.25、2.5、5、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得濃度分別為5.09、10.18、25.45、50.9、101.8、203.6 μg/mL的對照品溶液。進樣前用0.45 μm微孔膜過濾，取濾液進行HPLC分析[13]。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取青龍衣粉末2.00 g，置于100 mL錐形瓶中，加無水乙醇30 mL，25 ℃超聲提取40 min，過濾，3500 r/min離心15 min，取上清液定容到10 mL容量瓶中。進樣前用0.45 μm微孔膜過濾，取濾液進行HPLC分析。

2.2.3 標準曲線的繪制

依次取“2.2.1”項下對照品溶液各10 μL進樣，以胡桃醌濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程Y=38.10X-172.6，r=0.999 5，表明胡桃醌在5.09～203.6 μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗

取低、中、高濃度（23.11、42.98、124.87 μg/mL）樣品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣5次，結果RSD分別為1.52%、1.79%、1.34%。

2.4 穩定性試驗

將供試品溶液在一定時間內按上述色譜條件進樣，測定胡桃醌含量。結果室溫放置12 h內檢測，胡桃醌含量穩定；12～24 h檢測，胡桃醌含量略有下降；2 d后檢測，胡桃醌分解。

2.5 重復性試驗

取同一次采集的青龍衣，按上述方法制備5份供試品溶液，按上述色譜條件重復進樣，測定胡桃醌含量。結果胡桃醌平均含量為0.16%，RSD=1.53%。

2.6 加樣回收率試驗

精密量取已知含量供試品溶液6份，每份4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，依次加入1、2、3、4、5、6 mL對照品溶液（濃度20 μg/mL），并用無水乙醇分別定容至刻度，按上述色譜條件進樣測定。結果平均回收率為96.74%，RSD=1.73%。

2.7 單因素試驗考察

精密稱取青龍衣粉末2.00 g，通過單因素試驗，考察超聲提取時間（10～40 min）、提取溫度（20～35 ℃）、料液比（1∶10～1∶20）、乙醇濃度（80%～100%）對胡桃醌得率的影響。

2.7.1 提取時間

設定提取溫度30 ℃、料液比1∶15、乙醇濃度100%，考察提取時間10、20、30、40、50 min對胡桃醌得率的影響，結果依次為1.526、1.695、1.848、1.930、1.924 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趨勢，且在40 min達到最大，故提取時間以40 min為宜。

2.7.2 提取溫度

設定提取時間40 min、料液比1∶15、乙醇濃度100%，考察提取溫度20、25、30、35 ℃對胡桃醌得率的影響，結果依次為1.617、1.689、1.943、1.821 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趨勢，且在30 ℃達到最大，故提取溫度以30 ℃為宜。

2.7.3 料液比

設定提取時間40 min、提取溫度30 ℃、乙醇濃度100 %，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20對胡桃醌得率的影響，結果依次為1.460、1.644、1.580 mg/g。表明胡桃醌得率呈現先升高后降低趨勢，且在料液比為1∶15達到最大，故料液比以1∶15為宜。

2.7.4 乙醇體積分數

設定提取時間40 min、提取溫度30 ℃、料液比1∶15，考察乙醇濃度80%、90%、95%、100%對胡桃醌得率的影響，結果依次為1.388、1.613、1.849、1.684 mg/g。表明胡桃醌得率呈先升高后降低趨勢，且乙醇濃度為95%最大，故乙醇濃度以95%為宜。

2.8 響應面法優化試驗

在單因素試驗考察基礎上，根據Box-Behnken試驗組合原理，選取料液比、提取溫度、乙醇濃度為自變量，胡桃醌得率為響應值，采用Design-Expert7.1.3軟件設計試驗方案，因素水平見表1，試驗安排及結果見表2。

采用Design-Expert7.1.3軟件對胡桃醌提取工藝各因素進行回歸擬合，得回歸方程Y=2.02-0.12A+0.033B-0.003 125C+0.021AB+0.039AC+0.062BC-0.44A2-0.25B2-0.13C2，該模型的方差分析見表3。結果表明建立的回歸方程有統計學意義，模型R2=0.818 1，r=0.904 5，模型擬合度較好，試驗誤差小，可用此模型對青龍衣中胡桃醌的提取工藝進行預測分析，因素A、A2、B2和C2對胡桃醌得率有極顯著影響，因素B、C影響不顯著，交互項AB、AC、BC影響不顯著。

采用Design-Expert7.1.3軟件，根據擬合模型繪制青龍衣中胡桃醌含量響應面的等高線圖與響應面圖，可得到各參數范圍內的極值及因素間相互作用對響應值的影響，見圖2。結果顯示，該回歸方程存在極大值，最大響應值為2.034 mg/g。此時最優工藝條件為：料液比1∶14.30，乙醇濃度89.81%，提取溫度30.28 ℃。結合生產實際考慮，將最佳提取工藝調整為提取時間40 min，提取溫度30.50 ℃，乙醇濃度89.80%，料液比1∶14.30。

2.9 驗證試驗

精密稱取青龍衣粉末3份，每份2 g，按優選的提取工藝條件進行驗證試驗，結果胡桃醌平均得率為1.957 mg/g，與理論預測值相差較小，說明采用響應面法對青龍衣中胡桃醌的提取工藝進行參數優化結果準確可靠。

3 討論

我國地域遼闊，核桃楸樹種分布繁多，青龍衣資源豐富。研究發現，青龍衣治療胃痛及抗腫瘤等作用顯著，胡桃醌為其主要有效成分[14-15]。但胡桃醌不穩定，易分解、揮發的特點使其開發利用受到限制。隨著研究不斷深入，胡桃醌的提取工藝得到優化。

本試驗中，因超聲提取機械產熱會使水溫稍有升高，為防止胡桃醌受熱分解、揮發造成誤差，需不斷換水以保持水溫恒定。進行HPLC含量測定時，需平行進針以保證數據的可靠性。

在提取工藝方面，Box-Behnken響應面分析法可克服正交試驗只能處理離散型數據的缺陷，可連續對整個區域的各個水平進行分析，極大程度優化提取工藝。本研究在單因素試驗基礎上，通過對優選的料液比、提取溫度、乙醇濃度各水平的多元回歸及二項擬合，建立胡桃醌得率與各因素的回歸方程，得出料液比、提取溫度及乙醇濃度的平方項對胡桃醌得率影響顯著，并最終確定了最佳提取工藝，為青龍衣的資源化利用提供了參考依據。

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（收稿日期：2017-09-19）

（修回日期：2017-11-13；編輯：陳靜）