血流感染和皮膚軟組織感染金黃色葡萄球菌耐藥特征及多位點序列分型

溫偉洪， 徐令清， 李玉珍， 李介華， 湯英賢， 黃延峰

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是醫院感染與社區感染重要致病菌之一，可引起毒素性疾病和化膿性感染，常見于皮膚軟組織感染和血流感染。近年社區相關MRSA（community associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，CAMRSA）以及牲畜相關MRSA（livestock associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，LAMRSA）的出現使MRSA防治形勢更為嚴峻。了解金葡菌耐藥特征，可為臨床經驗用藥提供參考依據，減少抗生素不合理使用。金葡菌多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是基于對其7個管家基因測序的分子分型方法之一。管家基因高度保守，變化積累緩慢，因此金葡菌MLST主要用于了解菌株遺傳背景、起源和進化，其優勢在于具有高分型率及高重現性，不同實驗室數據可比對，缺點是分辨能力相對較低[1]。為了協助臨床更好對金葡菌感染防治，本文對本院血流和皮膚軟組織感染金葡菌耐藥性及MLST特征進行分析，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本院微生物室于2015年8月－2016年7月自門診和住院患者血培養樣本分離出金葡菌47株，自膿液或抽吸物樣本分離出金葡菌62株，剔除同一患者重復分離株，共109株金葡菌。其中47例血培養金葡菌分離株的患者因均有發熱和寒戰癥狀，體溫≥38 ℃，經臨床確診為血流感染。膿液或抽吸物培養出金葡菌的62例患者相應部位均有紅、腫等皮膚炎癥表現，經臨床確診為皮膚軟組織感染。質控菌株為金葡菌ATCC 25923。

1.1.2 主要儀器和試劑 BD PhoenixTM100全自動細菌鑒定藥敏系統、復合鑒定板（美國BD公司），細菌DNA提取試劑盒（Magen公司），重組溶葡萄球菌酶（上海生工），實時熒光定量PCR儀、凝膠電泳儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 金葡菌鑒定及藥敏檢測 采用BD PhoenixTM100全自動細菌鑒定藥敏系統進行金葡菌鑒定及藥敏檢測，藥敏判斷標準參照2016 CLSI M100-S26藥敏試驗指南。夫西地酸藥敏判斷標準參照EUCAST藥敏試驗指南，MIC≤1 mg/L為敏感，MIC≥2 mg/L為耐藥。MRSA判斷標準：金葡菌頭孢西丁MIC≥8 mg/L或苯唑西林MIC≥4 mg/L。金葡菌高水平莫匹羅星耐藥判斷標準：莫匹羅星MIC≥512 mg/L。

1.2.2 醫院相關MRSA（hospital associated methicillin-resistantStaphylococcus aureus，HAMRSA）、CA-MRSA判斷標準 按照衛生部制定的醫院感染診斷標準，患者入院48 h后獲得感染并分離的MRSA判斷為HA-MRSA。門診患者或入院48 h內獲得感染并分離的MRSA且患者1年內無醫療結構接觸史、無留置導管或醫療裝置判斷為CAMRSA[2]。

1.2.3 金葡菌MLST分型 按照MLST官網（http://saureus.mlst.net/）提供的引物序列、PCR反應條件、反應體系擴增金葡菌7個管家基因（arcC、aroE、glpF、

gmk、pta、tpi、yqiL），擴增產物送廣州勱致生物科技有限公司測序，測序結果與MLST官網數據庫進行比對獲得金葡菌序列型（sequence type，ST）。7個管家基因中6個相同定義為同一克隆復合體（clone complex，CC），兩種ST在單個位點不同定義為單位點變異體（single locus variant，SLV）。

1.2.4 統計分析 應用WHONET 5.6軟件統計細菌耐藥率，應用SPSS 19.0軟件分析血流感染與皮膚軟組織感染金葡菌中MRSA檢出率差異，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血流感染與皮膚軟組織感染金葡菌耐藥特征

血流和皮膚軟組織感染MRSA檢出率分別為21.3%和61.3%（10/47和38/62），兩者差異有統計學意義。未發現高水平莫匹羅星耐藥金葡菌，對非β內酰胺類抗菌藥物耐藥率和敏感率見表1。

2.2 血流感染金葡菌MLST結果

47株血流感染金葡菌共獲得18種ST，新型ST占10.6%（5/47）。ST965與ST5、ST630與ST239、ST338與ST59有一個位點不同，分別屬CC5、CC8、CC59，其他ST之間無遺傳相關性。10株MRSA含5種ST，最常見為ST59（40.0%，4/10），其次為ST45、ST188、ST239、ST338各1株；37株MSSA含16種ST，以ST7、ST188為主（各16.2%，6/37），其次為ST15（10.8%，4/37），見表2。

表1 血流和皮膚軟組織感染金葡菌對抗菌藥物耐藥率和敏感率Table 1 Susceptibility of the Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infection and skin and soft tissue infection to antimicobial agents

表2 血流感染金葡菌MLST分型Table 2 Multilocus sequence typing for the Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infection

表2 （續）Table 2（continued）

2.3 皮膚軟組織感染金葡菌MLST結果

62株皮膚軟組織感染金葡菌共獲得18種ST，新型ST占12.9%（8/62）。ST965與ST5，ST630與ST239，ST338、ST3188與ST59有一個位點不同，分別屬CC5、CC8、CC59，其他ST之間無遺傳相關性。38株MRSA含11種ST，最常見為ST338（47.4%，18/38），其次為ST59（13.2%，5/38）；24株MSSA含12種ST，以ST5、ST88為主（各12.5%，3/24），其次為ST7、ST188、ST398各2株，見表3。

表3 皮膚軟組織感染金葡菌MLST分型Table 3 Multilocus sequence typing for the Staphylococcus aureus isolates associated with skin and soft tissue infection

3 討論

MRSA對所有傳統β內酰胺類抗菌藥物耐藥（青霉素類、第一至第四代頭孢菌素、碳青霉烯類抗菌藥物），其主要的耐藥機制為mecA基因或mecC基因介導的甲氧西林耐藥，2014－2016年CHINET細菌耐藥監測網數據顯示MRSA平均檢出率分別為44.6%、42.2%、38.4%[3-5]。本組資料結果顯示血流感染MRSA檢出率為21.3%，低于近年CHINET細菌耐藥監測網報道MRSA平均檢出率。研究報道MSSA相對MRSA毒力基因攜帶率更高[6-7]，提示我們關注MRSA的同時，不能輕視MSSA感染。皮膚軟組織感染MRSA檢出率為61.3%，高于近年CHINET細菌耐藥監測網報道MRSA平均檢出率，提示皮膚軟組織感染金葡菌可能存在MRSA克隆株流行。

本組資料結果顯示血流感染和皮膚軟組織感染金葡菌對非β內酰胺類抗菌藥物有較高耐藥率的依次為紅霉素、克林霉素、四環素，其中克林霉素常推薦用于治療金葡菌引起的皮膚軟組織感染，而皮膚軟組織感染MRSA株和MSSA株對克林霉素耐藥率為分別為86.8%和29.2%，提示臨床克林霉素僅可經驗用于治療皮膚軟組織MSSA感染。對非β內酰類抗菌藥物包括慶大霉素、環丙沙星、利福平、甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率均≤30.0%，其中慶大霉素和利福平主要與敏感抗菌藥物聯合使用。對萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧、夫西地酸、高水平莫匹羅星耐藥率均為0，提示這些抗菌藥物可作為臨床治療金葡菌感染經驗用藥。

金葡菌MLST結果顯示血流感染MRSA株共有5種ST，文獻報道血流感染MRSA株優勢ST為ST239、ST5[8-9]，本組資料最常見為ST59（4/10，40.0%），其次為ST45、ST188、ST239、ST338各1株；MSSA株共有16種ST，每種ST不超20%，最常見為ST7、ST188（各16.2%，6/37）。皮膚軟組織感染MRSA株共有11種ST，文獻報道皮膚軟組織感染MRSA株優勢ST為ST59[10-11]，本組資料最常見為ST338（18/38，47.4%），其次為ST59（13.2%，5/38）；MSSA株共有12種ST，每種ST不超15%，最常見為ST5、ST88（各12.5%，3/24）。上述結果表明血流感染和皮膚軟組織感染MRSA株存在較明顯優勢ST，而MSSA株ST呈多樣化分布。LA-MRSA或LA-MSSA多屬于ST398[12-13]，本組資料結果顯示ST398金葡菌檢出率為4.6%（5/109），其中為血流感染MSSA 1株，皮膚軟組織感染MRSA與MSSA各2株，本地區農業人口較多，牲畜業較發達，因此需密切監測ST398金葡菌的流行。近年有關CA-MRSA報道愈來愈多，CA-MRSA與HA-MRSA相比毒力更強[14]，能引起健康人群感染，因此CA-MRSA備受關注。研究發現CA-MRSA可侵入醫院引起醫院感染，而HA-MRSA可擴散至社區[15-17]，本組資料血流感染和皮膚軟組織感染MRSA株MLST分型結果顯示，醫院和社區血流感染MRSA株中均檢出ST59型MRSA；醫院和社區皮膚軟組織感染MRSA株中均檢出ST45及ST338型，可見社區和醫院的遺傳背景愈來愈復雜，MRSA防控形式不容樂觀，相關部門應采取嚴格防控措施，避免醫院與社區之間高耐藥、高毒力的MRSA交叉傳播。

本組資料結果顯示109株金葡菌MLST結果中ST338最常見（19.3%，21/109），其次是ST59（11.9%，13/109），ST338為ST59的SLV，同屬CC59。90.5%（19/21）ST338金葡菌分離自皮膚軟組織感染，而53.8%（7/13）ST59金葡菌分離自血流感染，46.2%（6/13）ST59金葡菌分離自皮膚軟組織感染，ST59金葡菌進化到ST338金葡菌后是否產生毒力改變導致感染譜差異以及ST338金葡菌在皮膚軟組織感染流行機制有待日后研究。