一株氨化細菌的分離及其水體中氨氮去除能力分析

王瑗媛 譚好臣（濰坊市峽山水庫管理局，山東 濰坊 261000）

氮含量過高是引起水體富營養(yǎng)化的重要因素之一。水體中的有機氮依次經(jīng)過氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌、反硝化細菌的作用，轉(zhuǎn)化為NH4+-N、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、再轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮，最后以氮氣的形式從水體中釋放出來，這是微生物法控制水體中氮含量過高的主要方式[1]。由上述氮代謝過程來看，氨化細菌是氮循環(huán)過程中的限速微生物，因此，分離高效氨化細菌對廢水有機氮的降低，控制水體富營養(yǎng)化具有重要意義！

對氨化細菌的分離篩選的研究很多，目前已知的氨化細菌有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬（Pseudomonas）、缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、變形桿菌屬(Proteus)、沙雷菌屬(Serratia)及微球菌屬(Micrococcus)[2-4]。本研究是從山東某污水廠活性污泥中篩選、分離氨氮降解菌，對其形態(tài)、生理生化性質(zhì)、氨氮降解能力以及分類學位置進行了分析，為污（廢水）中高效氨化細菌的分離篩選以及水體富營養(yǎng)化控制提供一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

分離氨氮降解菌的活性污泥來自于山東某污水處理廠。

使用的化學試劑:硫酸銨、氯化鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、對氨基苯磺酸、α-奈胺均為分析純。

格里斯試劑配制：對氨基苯磺酸0.5克，溶入150mL 10%醋酸溶液中，得到溶液I；稱取α-萘胺0.1克，加入到50mL去離子水中，煮沸，再緩緩加入150mL 10%醋酸溶液，得到溶液II。溶液I溶液II分別保存在棕色瓶中，待用。

1.2 培養(yǎng)基組成

氨氮降解菌富集培養(yǎng)基[5]組成(g/L)：(NH4)2SO42 g，NaCl 0.3 g, FeSO4·7H2O 0.03 g, K2HPO41g,MgSO4·7H2O 0.03 g,NaHCO31.6 g,H2O 1L,pH 7.2，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基配制時加入瓊脂粉(15 g/L），半固體培養(yǎng)基配制時加入瓊脂粉（3 g/L）。

1.3 實驗方法

1.3.1 氨氮測定

氨氮測定采用納氏試劑分光光度法（國標法）。

1.3.2 氨氮降解菌富集及分離

取10 mL活性污泥加入到盛有200 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃條件下振蕩（160r/min）培養(yǎng)，每隔1 d取培養(yǎng)液，用格里斯試劑檢驗亞硝酸鹽的生成情況，根據(jù)紅色深淺判斷氨氮降解菌的繁殖情況。培養(yǎng)7 d后取10 mL富集培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的200 mL富集培養(yǎng)基中，重復上述操作3次。

取富集3次后的培養(yǎng)液0.03 mL劃線培養(yǎng)到固體平板培養(yǎng)基上，30℃條件下靜置培養(yǎng)7 d,分別取其中的單菌落重復劃線培養(yǎng)3次，將純化得到的12個單菌落分別保存到半固體氨氮降解菌富集培養(yǎng)基中，待用。

1.3.3 高效氨氮降解菌的篩選及其生理生化、生長曲線測定

對上述純化得到的12個單菌落分別用富集液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每隔1d取培養(yǎng)液用格里斯試劑檢驗，根據(jù)顏色深淺比較不同菌株的氨氮降解能力，選取顏色變化最深的菌株并將該菌株命名為AN-1，菌株AN-1即為氨氮降解能力最強的菌。然后對菌株AN-1的生理生化性質(zhì)進行測定，包括革蘭氏染色、糖發(fā)酵實驗、V.P實驗、淀粉水解實驗、MR實驗、明膠水解實驗、H2O2酶測定等，操作方法見參考文獻[6]。

生長曲線測定：用液體富集培養(yǎng)基對菌株AN-1進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH為7，培養(yǎng)溫度為30℃，振蕩培養(yǎng)（160r/min），每隔1 d測定培養(yǎng)液吸光度（OD560），作出時間-吸光度曲線。

1.3.4 不同條件對氨氮降解能力的影響測定

（1）不同pH條件對氨氮降解能力影響

將菌株AN-1接種到液體富集培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)3 d， 分別取富集培養(yǎng)液5 mL接種到 pH分別為6.0、7.0,8.0和9.0的195 mL富集培養(yǎng)基中，30℃條件下振蕩培養(yǎng)（160r/min）， 培養(yǎng)5 d后測定培養(yǎng)液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

（2）不同溫度條件對氨氮降解能力影響

取1.3.4（1）中富集培養(yǎng)液5 mL接種到195 mL富集培養(yǎng)基中，分別在10℃、20℃、30℃和40℃條件下振蕩（160r/min）培養(yǎng)5 d，測定培養(yǎng)液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

1.3.5 菌株AN-1的系統(tǒng)分類位置確定

（1）DNA提取

菌株AN-1 DNA的提取采用柱式基因組抽提試劑盒（UNIQ-10），提取方法按試劑盒說明書。

（2）PCR對菌株16S rDNA的擴增

PCR擴增引物采用細菌16S rDNA通用引物，引物序列：

正向引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；

反向引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′

（3）PCR反應體系以及反應條件

PCR反應體系（25μL）：2.5μL 5×Buffer（含Mg2+），0.5μL模板DNA，各0.5μL 7F（10uM）和1540R（10uM），1μL dNTP（各2.5mM），超純水定容至25μL。PCR反應條件：98℃預變性3min；98℃變性25 S，55℃退火25 S，72℃延伸1min， 30個循環(huán)，再72℃延伸10min，PCR擴增的序列由上海生工生物工程公司進行測序。

（4）系統(tǒng)樹的創(chuàng)建

將測得的16S rDNA序列發(fā)送到DDBJ(DNA Data Bank of Japan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/）數(shù)據(jù)庫中的Blast中進行比對，利用CustalX2.1和Mega5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件創(chuàng)建系統(tǒng)樹，采用的方法為鄰接法（Neighbor-Joining）[7-10]。

2 結果

2.1 菌株的分離和篩選

首先利用格里斯試劑對富集培養(yǎng)液進行初步檢測，篩選具有降解氨氮能力的菌株。然后對菌株進行多次馴化培養(yǎng)，最后用線培養(yǎng)法進行分離，共分離培養(yǎng)到12株氨氮降解菌，從中選取氨氮降解能力最強的菌株AN-1為代表菌株，用作后面的實驗。

2.2 生理生化

菌株AN-1在固體平板培養(yǎng)基上生長時，其菌落為乳白色圓形，表面濕潤光滑，顯微鏡觀察該菌為桿狀。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對氨氮降解菌AN-1的形態(tài)特征、生理生化特征等進行了鑒定,結果如表1所示。

表1 菌株AN-1的生理生化性質(zhì)Table1 Physio-chemical properties of the strainAN-1

2.3 菌株AN-1生長曲線測定

將菌株AN-1在液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，每隔1 d測定培養(yǎng)液的吸光度（OD560），并作成生長曲線，通過曲線得知菌株AN-1的停滯期較短，經(jīng)過24 h左右的培養(yǎng)后便進入了對數(shù)增長期。在培養(yǎng)到72 h時生物量達到最大，在此后的培養(yǎng)過程中，生物量基本保持不變。

2.4 不同pH條件下的氨氮去除率

將菌株AN-1的接種到pH分別為6.0、7.0、8.0和9.0的培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)到5 d時，測定培養(yǎng)液中剩余氨氮含量，分別求出氨氮降解率，作出pH-氨氮降解率曲線，通過曲線得出菌株AN-1在pH 8.0左右表現(xiàn)出最高的氨氮降解率，為78%。pH為9.0的培養(yǎng)基中生長時，菌株AN-1的降解率僅有47%，pH為6.0時的氨氮降解率為50%。由此可見，菌株AN-1的氨氮降解最適pH值在8.0左右，pH過高和過低都不利于氨氮降解。

2.5 不同溫度條件下的氨氮去除率

分別在10℃、20℃、30℃和40℃條件對菌株AN-1進行振蕩（160r/min）培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)基pH均為8，每隔1 d測定培養(yǎng)液中氨氮含量，求出氨氮去除率并作溫度-氨氮去除率曲線，如圖3所示。從圖1可以看出，菌株AN-1在30℃培養(yǎng)時，氨氮去除率最高，達77%。10℃條件下培養(yǎng)，其氨氮去除率僅為20%，40℃培養(yǎng)條件下的氨氮去除率為25%，稍高于10℃培養(yǎng)條件下的氨氮去除率。由此結果可以看出，菌株AN-1適宜生長的溫度為30℃左右，溫度過高或過低，都會降低其氨氮去除率。

圖1 培養(yǎng)溫度對菌株AN-1氨氮去除率影響Fig.3 The effect of cultivation temperature on NH4-N removal for strainAN-1

2.6 氨氮降解菌系統(tǒng)分類位置

經(jīng)過序列測定，菌株AN-1的16S rRNA的基因片段為1398 bp。通過數(shù)據(jù)庫DDBJ(DNADataBankofJapan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/），獲得菌株AN-1的登錄號為 AB917468。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)中，選取與菌株AN-1 16S rRNA序列同源性較高的基因序列，利用軟件CustalX2.1和Mega5.0創(chuàng)建系統(tǒng)樹（圖2）。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對菌株AN-1的16 S rRNA序列進行同源性分析，結果表明菌株AN-1與Shinella kummerowiae（EF070131）相似度最高，為96%。結合菌株AN-1在系統(tǒng)樹中的位置，可以判斷菌株AN-1屬于申氏桿菌屬,并初步命名為Shinella sp.AN-1(AB917468)。

圖2 菌株AN-1（AB917468）與申氏桿菌屬（Shinella）中近緣菌株16S rDNA序列的無根系統(tǒng)發(fā)育樹，采用方法為緊鄰法Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences showing the position of strainSKD-1within the family Shinella.Bar,0.005 substitutions per nucleotide position.

3 討論

本研究以氨氮（(NH4)2SO4）為唯一氮源配制培養(yǎng)基，從污水處理廠活性污泥中分離得到一株高效降解氨氮的細菌Shinella sp.AN-1(AB917468)，對其生理生化性質(zhì)、不同培養(yǎng)條件下的氨氮去除率以及分離學位置進行了分析。結果表明：細菌Shinella sp.AN-1(AB917468)為革蘭氏陰性菌，最適宜的生長條件為pH 8.0、溫度為30℃，此條件下的氨氮去除率最高，達78%。細菌Shinella sp.AN-1(AB917468)的16S rRNA序列分析表明，該菌株與申氏桿菌Shinella kummerowiae（EF070131）相似度最高，為96%，結合菌株在系統(tǒng)樹中的位置，確定菌株AN-1屬于申氏桿菌屬。實驗證明，本研究篩選到的申氏桿菌Shinella sp.AN-1(AB917468)具有較強的去除水體中氨氮的能力，為高氨氮廢水如養(yǎng)殖廢水中去除氨氮提供了新的菌種資源。但如要應用到實際的氨氮廢水處理中，還需要對具體的環(huán)境因素進行分析。另外，如果對菌株AN-1進行新菌種鑒定還需要進行DNA-DNA雜交，DNA G+C含量測定、脂肪酸組成分析等工作。