一株氨化細菌的分離及其水體中氨氮去除能力分析

王瑗媛 譚好臣（濰坊市峽山水庫管理局，山東 濰坊 261000）

氮含量過高是引起水體富營養化的重要因素之一。水體中的有機氮依次經過氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌、反硝化細菌的作用，轉化為NH4+-N、亞硝態氮、硝態氮、再轉化為硝態氮、亞硝態氮，最后以氮氣的形式從水體中釋放出來，這是微生物法控制水體中氮含量過高的主要方式[1]。由上述氮代謝過程來看，氨化細菌是氮循環過程中的限速微生物，因此，分離高效氨化細菌對廢水有機氮的降低，控制水體富營養化具有重要意義！

對氨化細菌的分離篩選的研究很多，目前已知的氨化細菌有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬（Pseudomonas）、缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)、糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、變形桿菌屬(Proteus)、沙雷菌屬(Serratia)及微球菌屬(Micrococcus)[2-4]。本研究是從山東某污水廠活性污泥中篩選、分離氨氮降解菌，對其形態、生理生化性質、氨氮降解能力以及分類學位置進行了分析，為污（廢水）中高效氨化細菌的分離篩選以及水體富營養化控制提供一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

分離氨氮降解菌的活性污泥來自于山東某污水處理廠。

使用的化學試劑:硫酸銨、氯化鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、對氨基苯磺酸、α-奈胺均為分析純。

格里斯試劑配制：對氨基苯磺酸0.5克，溶入150mL 10%醋酸溶液中，得到溶液I；稱取α-萘胺0.1克，加入到50mL去離子水中，煮沸，再緩緩加入150mL 10%醋酸溶液，得到溶液II。溶液I溶液II分別保存在棕色瓶中，待用。

1.2 培養基組成

氨氮降解菌富集培養基[5]組成(g/L)：(NH4)2SO42 g，NaCl 0.3 g, FeSO4·7H2O 0.03 g, K2HPO41g,MgSO4·7H2O 0.03 g,NaHCO31.6 g,H2O 1L,pH 7.2，121℃滅菌20min。固體培養基配制時加入瓊脂粉(15 g/L），半固體培養基配制時加入瓊脂粉（3 g/L）。

1.3 實驗方法

1.3.1 氨氮測定

氨氮測定采用納氏試劑分光光度法（國標法）。

1.3.2 氨氮降解菌富集及分離

取10 mL活性污泥加入到盛有200 mL富集培養基的三角瓶中，30℃條件下振蕩（160r/min）培養，每隔1 d取培養液，用格里斯試劑檢驗亞硝酸鹽的生成情況，根據紅色深淺判斷氨氮降解菌的繁殖情況。培養7 d后取10 mL富集培養液轉接到新鮮的200 mL富集培養基中，重復上述操作3次。

取富集3次后的培養液0.03 mL劃線培養到固體平板培養基上，30℃條件下靜置培養7 d,分別取其中的單菌落重復劃線培養3次，將純化得到的12個單菌落分別保存到半固體氨氮降解菌富集培養基中，待用。

1.3.3 高效氨氮降解菌的篩選及其生理生化、生長曲線測定

對上述純化得到的12個單菌落分別用富集液體培養基進行培養，每隔1d取培養液用格里斯試劑檢驗，根據顏色深淺比較不同菌株的氨氮降解能力，選取顏色變化最深的菌株并將該菌株命名為AN-1，菌株AN-1即為氨氮降解能力最強的菌。然后對菌株AN-1的生理生化性質進行測定，包括革蘭氏染色、糖發酵實驗、V.P實驗、淀粉水解實驗、MR實驗、明膠水解實驗、H2O2酶測定等，操作方法見參考文獻[6]。

生長曲線測定：用液體富集培養基對菌株AN-1進行培養，培養基pH為7，培養溫度為30℃，振蕩培養（160r/min），每隔1 d測定培養液吸光度（OD560），作出時間-吸光度曲線。

1.3.4 不同條件對氨氮降解能力的影響測定

（1）不同pH條件對氨氮降解能力影響

將菌株AN-1接種到液體富集培養基中進行培養3 d， 分別取富集培養液5 mL接種到 pH分別為6.0、7.0,8.0和9.0的195 mL富集培養基中，30℃條件下振蕩培養（160r/min）， 培養5 d后測定培養液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

（2）不同溫度條件對氨氮降解能力影響

取1.3.4（1）中富集培養液5 mL接種到195 mL富集培養基中，分別在10℃、20℃、30℃和40℃條件下振蕩（160r/min）培養5 d，測定培養液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

1.3.5 菌株AN-1的系統分類位置確定

（1）DNA提取

菌株AN-1 DNA的提取采用柱式基因組抽提試劑盒（UNIQ-10），提取方法按試劑盒說明書。

（2）PCR對菌株16S rDNA的擴增

PCR擴增引物采用細菌16S rDNA通用引物，引物序列：

正向引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；

反向引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′

（3）PCR反應體系以及反應條件

PCR反應體系（25μL）：2.5μL 5×Buffer（含Mg2+），0.5μL模板DNA，各0.5μL 7F（10uM）和1540R（10uM），1μL dNTP（各2.5mM），超純水定容至25μL。PCR反應條件：98℃預變性3min；98℃變性25 S，55℃退火25 S，72℃延伸1min， 30個循環，再72℃延伸10min，PCR擴增的序列由上海生工生物工程公司進行測序。

（4）系統樹的創建

將測得的16S rDNA序列發送到DDBJ(DNA Data Bank of Japan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/）數據庫中的Blast中進行比對，利用CustalX2.1和Mega5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件創建系統樹，采用的方法為鄰接法（Neighbor-Joining）[7-10]。

2 結果

2.1 菌株的分離和篩選

首先利用格里斯試劑對富集培養液進行初步檢測，篩選具有降解氨氮能力的菌株。然后對菌株進行多次馴化培養，最后用線培養法進行分離，共分離培養到12株氨氮降解菌，從中選取氨氮降解能力最強的菌株AN-1為代表菌株，用作后面的實驗。

2.2 生理生化

菌株AN-1在固體平板培養基上生長時，其菌落為乳白色圓形，表面濕潤光滑，顯微鏡觀察該菌為桿狀。根據《常見細菌系統鑒定手冊》對氨氮降解菌AN-1的形態特征、生理生化特征等進行了鑒定,結果如表1所示。

表1 菌株AN-1的生理生化性質Table1 Physio-chemical properties of the strainAN-1

2.3 菌株AN-1生長曲線測定

將菌株AN-1在液體培養基中進行振蕩培養，每隔1 d測定培養液的吸光度（OD560），并作成生長曲線，通過曲線得知菌株AN-1的停滯期較短，經過24 h左右的培養后便進入了對數增長期。在培養到72 h時生物量達到最大，在此后的培養過程中，生物量基本保持不變。

2.4 不同pH條件下的氨氮去除率

將菌株AN-1的接種到pH分別為6.0、7.0、8.0和9.0的培養基中進行振蕩培養，培養溫度為30℃，培養到5 d時，測定培養液中剩余氨氮含量，分別求出氨氮降解率，作出pH-氨氮降解率曲線，通過曲線得出菌株AN-1在pH 8.0左右表現出最高的氨氮降解率，為78%。pH為9.0的培養基中生長時，菌株AN-1的降解率僅有47%，pH為6.0時的氨氮降解率為50%。由此可見，菌株AN-1的氨氮降解最適pH值在8.0左右，pH過高和過低都不利于氨氮降解。

2.5 不同溫度條件下的氨氮去除率

分別在10℃、20℃、30℃和40℃條件對菌株AN-1進行振蕩（160r/min）培養5 d，培養基pH均為8，每隔1 d測定培養液中氨氮含量，求出氨氮去除率并作溫度-氨氮去除率曲線，如圖3所示。從圖1可以看出，菌株AN-1在30℃培養時，氨氮去除率最高，達77%。10℃條件下培養，其氨氮去除率僅為20%，40℃培養條件下的氨氮去除率為25%，稍高于10℃培養條件下的氨氮去除率。由此結果可以看出，菌株AN-1適宜生長的溫度為30℃左右，溫度過高或過低，都會降低其氨氮去除率。

圖1 培養溫度對菌株AN-1氨氮去除率影響Fig.3 The effect of cultivation temperature on NH4-N removal for strainAN-1

2.6 氨氮降解菌系統分類位置

經過序列測定，菌株AN-1的16S rRNA的基因片段為1398 bp。通過數據庫DDBJ(DNADataBankofJapan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/），獲得菌株AN-1的登錄號為 AB917468。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據中，選取與菌株AN-1 16S rRNA序列同源性較高的基因序列，利用軟件CustalX2.1和Mega5.0創建系統樹（圖2）。利用NCBI數據庫對菌株AN-1的16 S rRNA序列進行同源性分析，結果表明菌株AN-1與Shinella kummerowiae（EF070131）相似度最高，為96%。結合菌株AN-1在系統樹中的位置，可以判斷菌株AN-1屬于申氏桿菌屬,并初步命名為Shinella sp.AN-1(AB917468)。

圖2 菌株AN-1（AB917468）與申氏桿菌屬（Shinella）中近緣菌株16S rDNA序列的無根系統發育樹，采用方法為緊鄰法Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences showing the position of strainSKD-1within the family Shinella.Bar,0.005 substitutions per nucleotide position.

3 討論

本研究以氨氮（(NH4)2SO4）為唯一氮源配制培養基，從污水處理廠活性污泥中分離得到一株高效降解氨氮的細菌Shinella sp.AN-1(AB917468)，對其生理生化性質、不同培養條件下的氨氮去除率以及分離學位置進行了分析。結果表明：細菌Shinella sp.AN-1(AB917468)為革蘭氏陰性菌，最適宜的生長條件為pH 8.0、溫度為30℃，此條件下的氨氮去除率最高，達78%。細菌Shinella sp.AN-1(AB917468)的16S rRNA序列分析表明，該菌株與申氏桿菌Shinella kummerowiae（EF070131）相似度最高，為96%，結合菌株在系統樹中的位置，確定菌株AN-1屬于申氏桿菌屬。實驗證明，本研究篩選到的申氏桿菌Shinella sp.AN-1(AB917468)具有較強的去除水體中氨氮的能力，為高氨氮廢水如養殖廢水中去除氨氮提供了新的菌種資源。但如要應用到實際的氨氮廢水處理中，還需要對具體的環境因素進行分析。另外，如果對菌株AN-1進行新菌種鑒定還需要進行DNA-DNA雜交，DNA G+C含量測定、脂肪酸組成分析等工作。