紫外-可見分光光度法測定沙棘葉總黃酮 含量的優(yōu)化試驗(yàn)

梁愛軍

(1.山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012;2.國家林業(yè)局沙棘工程技術(shù)研究中心，山西 太原 030012))

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)，胡頹子科沙棘屬落葉灌木，由于其耐旱、抗風(fēng)沙的特性，被廣泛應(yīng)用于水土保持造林中。沙棘是一種重要的藥食同源植物，其根、葉、花、果實(shí)、種子中含有黃酮、原花青素、維生素等多種營養(yǎng)成分，特別是沙棘葉中的黃酮類物質(zhì)遠(yuǎn)大于其它部位，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，沙棘黃酮具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化、降低血脂膽固醇水平、延緩衰老等作用。沙棘葉總黃酮的測定方法主要有分光光度法與高效液相色譜法。高效液相色譜法主要用于測定黃酮單體成分，具有精確度高、誤差小的優(yōu)點(diǎn)，但操作復(fù)雜、檢測成本較高。分光光度法主要用于測定總黃酮含量，一般采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色體系，但對(duì)于NaNO2，Al(NO3)3，NaOH的加入量與顯色時(shí)間的文獻(xiàn)報(bào)道均不一致。因此，筆者對(duì)沙棘葉樣品溶液中總黃酮含量進(jìn)行分析比較，以期建立最優(yōu)的測定沙棘葉總黃酮含量的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘葉采自山西省關(guān)帝林局龍興林場(5月至10月混合)；蘆丁、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑皆為市售國產(chǎn)分析純。

儀器有電子天平(青島紫泉儀器有限公司)，鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海博訊有限公司)，紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，臺(tái)式離心機(jī)(賽歐斯天津科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將沙棘葉于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥6 h，粉碎機(jī)粉碎，過80目篩后備用。

1.2.2 樣品溶液的制備

精確稱取5 g沙棘葉粉末，加60%乙醇50 mL，水浴加熱2 h，離心過濾，定容至100 mL容量瓶中。之后再從容量瓶中取25 mL液體定容到50 mL容量瓶中備用。

1.2.3 空白參比的選擇

將樣品溶液、5%NaNO2溶液、10%Al(NO3)3溶液、4% NaOH溶液以不同組合方式，用30%乙醇定容至25 mL容量瓶中，于510 nm處測定吸光度值。

1.2.4 稀釋定容乙醇濃度的選擇

精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，分別用30%，40%，50%，60%，70%乙醇定容，于510 nm處測定吸光度值。

1.2.5 顯色劑加入量的選擇

精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，每次只改變一個(gè)劑量因素，用30%乙醇定容，于510 nm處測定吸光度值。

1)加入4%NaNO2溶液0.3 mL，0.5 mL，0.7 mL，1.0 mL，10%Al(NO3)3溶液1 mL，4%NaOH溶液10 mL.

2)加入4%NaNO2溶液1 mL，10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，0.5 mL，0.7 mL，1.0 mL，4%NaOH溶液10 mL.

3)加入4%NaNO2溶液1 mL，10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，4%NaOH溶液4 mL，6 mL，8 mL，10 mL.

1.2.6 顯色時(shí)間的選擇

精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，每次只改變一個(gè)靜置時(shí)間因素，用30%乙醇定容，于510 nm處測定吸光度值。

1)加入4% NaNO2溶液1 mL，靜置2 min，4 min，6 min，8 min，10 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，靜置6 min；4% NaOH溶液10 mL，靜置15 min.

2)加入4% NaNO2溶液1 mL，靜置6 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，靜置2 min，4 min，6 min，8 min，10 min；4% NaOH溶液10 mL，靜置15 min.

3)加入4% NaNO2溶液1 mL，靜置6 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，靜置6 min；4%NaOH溶液10 mL，靜置5 min，10 min，15 min，20 min，25 min.

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配置0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL.之后加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min.再加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻靜置6 min.再加4%NaOH溶液10 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min，于510 nm處測定吸光度。以X軸為蘆丁濃度，Y軸為吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 沙棘葉總黃酮的計(jì)算

式中：w——沙棘葉總黃酮含量，mg/g；

c——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的沙棘葉總黃酮濃度，mg/mL；

v——提取液總體積，mL；

d——稀釋倍數(shù)；

m——沙棘葉粉末質(zhì)量，g.

2 結(jié)果與分析

2.1 空白參比的選擇

不同空白參比的吸光度見圖1.

圖1 不同空白參比的吸光度

由圖1可以看出，試劑空白亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉組(B+C+D)的吸光度值最低。由于樣品本身有顏色，試劑空白不能排除樣品中色素及一些其它有色雜質(zhì)的吸光度，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高。樣品溶液-亞硝酸鈉組(A+B)、樣品溶液-硝酸鋁組(A+C)的吸光度稍大于樣品溶液組(A)的吸光度，表明單獨(dú)加入亞硝酸鈉或硝酸鋁與樣品溶液中的少部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。樣品溶液-亞硝酸鈉-硝酸鋁組(A+B+C)的吸光度與樣品測定(A+B+C+D)的吸光度基本接近，表明同時(shí)加入亞硝酸鈉與硝酸鋁與樣品溶液中的大部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。因此，選擇樣品溶液組(A)作為空白參比較好。

2.2 稀釋定容乙醇濃度的選擇

不同稀釋定容乙醇濃度的吸光度值見圖2.

圖2 稀釋定容不同乙醇濃度的吸光度

由圖2可知，用30%，40%，50%，60%乙醇定容的吸光度值基本相近，因此乙醇濃度對(duì)該方法的最終顯色影響不是很大。用70%乙醇定容的吸光度值稍高一些，可以選用70%乙醇稀釋定容。

2.3 顯色劑加入量的選擇

顯色劑加入量對(duì)吸光度值的影響見表1.

表1 顯色劑加入量對(duì)吸光度值的影響

由表1可以看出，顯色劑NaNO2，Al(NO3)3，NaOH的不同加入量對(duì)吸光度值的影響不顯著，說明顯色劑加入量的多少不影響吸光度值。為了節(jié)約試劑，選擇NaNO20.3 mL，Al(NO3)30.3 mL，NaOH 4 mL.

2.4 顯色時(shí)間的選擇

顯色劑顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響見表2.

表2 顯色劑顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響

由表2可知，NaNO2靜置時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果基本無影響，所以加入NaNO2后可直接加入Al(NO3)3，不必再搖勻靜置。加入Al(NO3)36 min后，吸光度值趨于穩(wěn)定，說明Al(NO3)3與黃酮類化合物的絡(luò)合反應(yīng)至少需要6 min才能完成。加入NaOH 10 min～15 min吸光度值基本沒變化，靜置25 min吸光度值減小。因此，加入NaOH后搖勻靜置10 min即可，最長靜置20 min.

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

通過測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3.

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 沙棘葉總黃酮含量的測定

在上述得出的最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行測定，取1 mL樣液于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO20.3 mL，加入10% Al(NO3)30.3 mL，搖勻靜置6 min.然后加入4% NaOH 4 mL，搖勻靜置10 min，用70%乙醇定容至刻度。以只加樣品溶液為空白參比，于510 nm處測定吸光度值，得到沙棘葉總黃酮提取率為1.94%，1.99%，2.10%，平均提取率為2.01%.

3 討論

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測定沙棘葉總黃酮含量時(shí)，空白參比、稀釋定容乙醇的濃度、試劑加入量與顯色時(shí)間對(duì)測定結(jié)果均有一定影響。因此，必須嚴(yán)格保證空白參比、稀釋定容乙醇的濃度、試劑加入量與顯色時(shí)間等試驗(yàn)環(huán)節(jié)前后完全一致，否則會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高或偏低，出現(xiàn)較大的誤差。