焦磷酸測序鑒定建澤瀉方法的建立

福建省醫學科學研究院/福建省醫學測試重點實驗室，福建 福州 350001

澤瀉為多年沼生澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.)Juzep.的干燥塊莖，最早歷史記載可追溯到《神農本草經》。其性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效[1]，主要有利尿[2]、降血糖[3-5]，降血脂[6-9]等活性。澤瀉主產福建、四川、江西等地，素有“建澤瀉”、“川澤瀉”、“江澤瀉”之稱，以建澤瀉、川澤瀉量大且使用廣泛，其中又以建澤瀉質佳，被載入中國的道地藥材。目前主要采用性狀鑒別和化學成分分析對澤瀉進行鑒定，該方法鑒定結果主觀性較強，準確性無法得到保證。焦磷酸測序技術(Pyrosequencing) 是一種基于酶催化反應的新一代測序技術，其精確性和可重復性高，并能夠實時、直觀地提供序列信息，同時能定性定量分析差異堿基。該技術利用生物素標記一條擴增引物，擴增產物無需熒光標記與電泳分離，因此操作更為簡便、快捷。本實驗采收福建省建甌建澤瀉藥材，同時以川澤瀉作為對照藥材(采自四川省眉山)，采用焦磷酸測序方法鑒定其基源，為今后澤瀉的質量控制研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 PCR儀(美國Bio-Rad)；高速離心機(德國eppendorf)；生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；超微量核酸/蛋白分析儀(英國Biochrom)；數顯恒溫水浴鍋(江南儀器廠)；電泳儀(六一儀器廠)；暗箱式紫外投射儀(上海顧村電光儀器廠)；實時定量焦磷酸測序儀(凱杰生物工程有限公司)；恒溫孵育器(德國eppendorf)。

1.2 材料 建澤瀉藥材采自福建省建甌吉陽鎮，川澤瀉藥材采自四川省眉山市彭山區謝家鎮，經福建省醫學科學研究院徐榕青研究員鑒定為澤瀉科植物澤瀉。分別取建澤瀉與川澤瀉的須根、葉柄及葉片樣本。

1.3 試劑 Binding Buffer、Denaturation Solution、Wash Buffer、annealing buffer、PyroMark Gold Q 24 Reagents均購自凱杰生物工程有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix(AS111-14)購自北京全式金生物技術有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)購自美國BIOSHAPR；三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖購自美國NOVON；其余試劑均為國產分析純；實驗引物由鉑尚生物技術公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取 采用的改良CTAB法分別提取建澤瀉、川澤瀉的須根、葉柄及葉片DNA。

2.2 PCR擴增 25 μL PCR擴增體系中包含有1 μL DNA模板(約50～100 ng)，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，10 μmol/L上下游引物各1 μL(引物序列見表1)，用ddH2O補足至25 μL。擴增條件為94℃-5 min；(94℃-30 s，58℃-30 s，72℃-45 s)×30 cycle；72℃-5 min；擴增產物保存于4℃。

表1 引物序列

2.3 焦磷酸測序 取5 μL PCR產物、1 μL的beads、40 μL bingding buffer，補足MQ至80 μL，25℃1400rpm振蕩孵育10 min。經變性和洗滌后，使未標記生物素的DNA單鏈與已標記單鏈分離，將含有beading的反應板于80℃孵育2 min后冷卻至室溫。試劑倉中加入所需的酶、底物和dNTP等進行檢測。

2.4 測序驗證 中藥材DNA條形碼鑒定系統中查詢所得ITS2序列上游引物：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，下游:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR擴增條件為94℃-5 min；(94℃-30 s，56℃-30 s，72℃-45 s)×30 cycle；72℃—10 min；擴增產物于4℃保存。未經純化的PCR產物送鉑尚生物技術有限公司測序。

3 結果與分析

3.1 焦磷酸測序結果 采用焦磷酸測序技術進行SNP分析。根據ITS2位點突變情況，得兩種峰圖，建澤瀉(含須根、葉柄、葉片)突變位點堿基為A(如圖1所示)，川澤瀉(含須根、葉柄、葉片)突變位點堿基為T(如圖2所示)，二者突變頻率均不小于83%(見表2)。

表2 樣本的具體突變情況及頻率

3.2 測序驗證結果 測序序列與下載序列見表3，同時由圖3可以看出，建澤瀉ITS2序列與東方澤瀉一致，與澤瀉存在A-T突變；川澤瀉ITS2序列與澤瀉一致，與東方澤瀉存在A-T突變。有研究表明東方澤瀉與澤瀉在ITS2序列上的A-T變異是穩定突變，因此可準確鑒定這兩個物種[10]。故可判斷建澤瀉與東方澤瀉基源一致，即Alismaorientalis(Sam.)Juzep.

表3 澤瀉測序結果及下載序列信息表

4 討論

實驗采用焦磷酸測序技術對ITS2突變位點進行研究，發現建澤瀉與川澤瀉在突變位點堿基不同，且毛細管電泳測序技術進一步驗證了這一結果，說明焦磷酸測序結果的準確性，因此本實驗建立的基于ITS2突變位點的焦磷酸鑒定技術能準確鑒定不同產地的澤瀉物種。與直接測序法相比，焦磷酸測序所用DNA不需要經過凝膠電泳純化和熒光標記，測序過程中可對測序結果實時觀察，同時能定性定量分析差異堿基，靈敏度高，操作便捷，適合已知序列的DNA短片段測序，是一種適用于中藥材的分子生物學鑒定手段。