乳腺癌組織miR-20a的表達及其對乳腺癌細胞自噬的影響

韓濤，曹明

(蕪湖市第一人民醫院，a乳腺外科,b病理科，安徽 蕪湖 241000)

乳腺癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率仍呈增高趨勢[1-2]。晚期乳腺癌可轉移至骨、肺等重要臟器，致死率較高，嚴重威脅我國女性健康，因此進一步探究乳腺癌發生發展的分子機制、尋找早期診斷與評估預后的分子指標具有重要意義[3-4]。細胞自噬作為真核細胞的自我降解機制，消除廢舊蛋白、衰老細胞器及胞內病原體以維持內環境穩態，而自噬功能障礙可作為細胞癌變的因素之一[5]。微小非編碼RNA(miRNA)是一類長度僅18～24個核苷酸、高度保守的單鏈RNA，通過靶向目的mRNA并使之降解，發揮轉錄后基因表達的調控功能，目前已證明多種miRNA參與乳腺癌的發生發展[6]。在宮頸癌中miR-20a 可通過降低ATG7的表達抑制自噬，促進宮頸腫瘤的發生與淋巴結轉移，然而miR-20a在乳腺癌中的作用仍有待進一步研究[7]。本研究觀察了乳腺癌組織中miR-20a及多種自噬相關基因的表達，并利用乳腺癌細胞系MCF7細胞初步探究了二者的相互作用，報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取蕪湖市第一人民醫院乳腺外科于2016年1月至2017年12月間收治的接受手術治療的乳腺癌患者56例，年齡(50.9±11.3)歲，年齡范圍為33～82歲，其中右乳手術21例，左乳35例。患者接受乳腺癌保乳術31例，改良乳腺癌根治術20例，腫塊切除術3例，單純乳房切除術2例。根據術后病理檢查，患者中Luminal A型乳腺癌17例，Luminal B型乳腺癌23例，三陰性乳腺癌9例，Her-2(3+)乳腺癌5例，Her-2(2+)乳腺癌2例。合并高血壓患者8例，合并糖尿病患者3例，所有患者均無飲酒史或吸煙史。本研究獲我院倫理委員會批準，患者或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2材料DMEM基礎培養基購自Gibco公司；Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔IgG、Lipofectamine 2000 Reagent由invitrogen公司提供；mir VanaTMmiRNA Isolation試劑盒購自美國Ambion公司。RT cDNA第一鏈合成試劑盒為Frdbio公司產品；焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)購自廣州捷倍斯生物科技有限公司，兔抗人Beclin1多克隆抗體、兔源抗LC3多克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Abcam公司。pcDNA3/pri-miR-20a表達載體由上海Tolo Biotech生物科技有限公司構建，所用引物序列為pri-miR-20a-S：5′-GCGAGATCTAGTTGTGCAAATCTATGC-3′、pri-miR-20a-A：5′-GGCGAATTCTAACCA TAGAACAGTGTTC-3′，酶切位點分別為BamH 1、EcoR 1。MCF7細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。各引物均由上海生工生物有限公司合成，序列如表1。

1.3方法

1.3.1組織的總RNA提取與逆轉錄實時定量PCR檢測 將乳腺癌患者手術切取的新鮮腫瘤組織與癌旁組織置于-80 ℃冰箱凍存。提取總RNA時取適量凍存組織，迅速稱重后置于DEPC預處理的研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末狀后，按質量體積比為1∶2加入裂解液繼續勻漿，繼而采用 mir VanaTMmiRNA Isolation試劑盒嚴格按說明書操作以提取并純化大片段RNA與小片段RNA，采用紫外分光光度計測定RNA濃度后凍存于-80℃備用。逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)時先應用RT-PCR逆轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，采用SYBR greenⅠ染料法在LightCycler480 RT-PCR儀上分別檢測miR-20a及自噬相關基因Beclin1、LC3、ATG5及ATG7 mRNA的表達水平。miR-20a檢測以U6 snoRNA為內參，mRNA檢測以GAPDH mRNA為內參，相對定量法算得標準曲線及各待檢RNA的相對表達量[8]。

表1 實時定量PCR擴增引物序列

1.3.2脂質體法轉染pcDNA3/pri-miR-20a至MCF7細胞 乳腺癌細胞系MCF7細胞采用含10%胎牛血清與10 U·mL-1青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養基培養。常規條件下培養細胞至融合率約85%，以細胞消化液消化細胞并按2×105個每孔接種至六孔細胞培養板培養12 h。3 μg·mL-1的pcDNA3/pri-miR-20a質粒與pcDNA3空白質粒分別按質量體積比1∶3與Lipofectamine 2000 Reagent混懸并轉染細胞，倒置顯微鏡觀察細胞狀態。

1.3.3免疫蛋白印記實驗檢測MCF7細胞Beclin 1與饑餓條件下LC3Ⅱ的表達 MCF7細胞轉染48 h后，棄去培養基并以預冷的PBS沖洗細胞，加入細胞裂解液充分吹打細胞，并置于水平搖床平搖20 min后獲得裂解產物，轉移至EP管后以15 000 r·min-1低溫離心15 min，收集上清并加入上樣緩沖液，煮沸5 min并冷卻后，樣本按等體積進行SDS-PAGE 電泳分離。電轉至PVDF膜并封閉后，采用兔抗人Beclin 1單克隆抗體或兔抗人GAPDH單克隆抗體按1∶1 000稀釋后孵育PVDF膜，在4 ℃水平搖床慢搖10 h后洗膜，爾后加入1∶3 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，化學發光法顯示信號。成像系統采集圖像后，分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。檢測饑餓條件下MCF7細胞LC3Ⅱ的表達前，棄去轉染后細胞的培養基，加入Hank′平衡鹽溶液處理20 min后進行LC3Ⅱ的免疫蛋白印記實驗檢測。一抗孵育時采用1∶1 000稀釋的兔源抗LC3多克隆抗體，其他條件與檢測Beclin 1時相同。

1.3.4免疫熒光實驗觀察饑餓條件下MCF7細胞LC3蛋白的分布 MCF7細胞轉染pcDNA3/pri-miR-20a質粒或pcDNA3空白質粒后，采用Hank′平衡鹽溶液饑餓細胞。20 min后棄去溶液，輕柔滴加預冷的甲醇，爾后將細胞培養板置于-20 ℃冰箱固定細胞20 min。棄去甲醇，滴加3% BSA并于37 ℃恒溫箱封閉60 min，繼而以1∶300稀釋的兔源LC3多克隆抗體于37 ℃孵育60 min，PBST洗滌后加入Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔 IgG。室溫孵育60 min后以0.01 μg·mL-1DAPI溶液對細胞核著色，用熒光倒置顯微鏡觀察圖像。

2 結果

2.1乳腺癌組織中miR-20a的表達高于癌旁組織

通過qRT-PCR技術對56例乳腺癌患者腫瘤組織與癌旁組織的miR-20a表達水平的檢測發現，腫瘤組織miR-20a的平均表達水平為211.35±67.43，明顯高于癌旁組織126.72±24.37，差異有統計學意義(P<0.05)，初步表明miR-20a的表達上調與乳腺癌的發生存在一定的相關性。

2.2乳腺癌組織中Beclin1mRNA的相對表達量低于癌旁組織在檢測miR-20a表達的同時，我們還采用qRT-PCR技術檢測了6例患者腫瘤組織與癌旁組織4種自噬相關基因mRNA的表達。結果顯示該組患者腫瘤組織Beclin1 mRNA的相對表達量明顯低于癌旁組織(P<0.05)，而ATG5、ATG7及ATG12 mRNA表達水平的兩組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 乳腺癌與癌旁組織中4種自噬相關基因mRNA的相對表達量

2.3過表達miR-20a抑制MCF7細胞Beclin1的表達為探究乳腺癌組織中miR-20a表達升高是否參與Beclin1 mRNA表達水平的下調，我們采用乳腺癌細胞系MCF7細胞，通過脂質體轉染pcDNA3/pri-miR-20a重組質粒過表達miR-20a，以表達載體pcDNA3質粒作為對照，免疫蛋白印記實驗檢測Beclin1表達水平。結果顯示，過表達miR-20a后MCF7細胞Beclin1蛋白相對表達量為0.18±0.12，較載體對照組0.72±0.11及空白對照組0.70±0.45細胞顯著降低(P<0.05)，而載體對照組與空白對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.4過表達miR-20a抑制饑餓條件下MCF7細胞LC3Ⅱ的表達在自噬通路激活與自噬體構建的過程中，Beclin1作為調節分子發揮了關鍵性作用。為觀察乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中Beclin1表達下調對自噬功能的影響，我們采用Hank′平衡鹽溶液替代培養基對細胞進行饑餓處理，進而檢測功能狀態下的自噬標記蛋白LC3Ⅱ的表達水平。免疫蛋白印記顯示過表達miR-20a后，饑餓刺激下的MCF7細胞LC3Ⅱ的表達量低于載體對照組與空白對照組細胞，顯示其自噬活化受到抑制(圖2)。

2.5過表達miR-20a抑制饑餓條件下MCF7細胞的自噬體構建自噬體的構建是顯示自噬水平增高的重要依據，因此我們采用免疫熒光實驗標記自噬體膜蛋白LC3，根據LC3聚集為斑點狀反映自噬體形成。熒光倒置顯微鏡下可見，通過饑餓誘導MCF7細胞自噬后載體對照組與空白對照組細胞中分布大量紅色熒光斑點，而過表達miR-20a后MCF7細胞的細胞質之中紅色斑點較少，進一步反映了miR-20a抑制MCF7細胞的自噬活化(圖3)。

3 討論

近年來，對于miRNA在腫瘤發生發展中作用的研究愈加廣泛和深入。其中，miR-20a參與了多種癌癥進展的分子病理過程[9]。在非小細胞肺癌中，miR-20a通過靶向早期生長反應蛋白2促進癌細胞的擴散與侵襲[10]，并且患者外周血中高循環miR-20a與非小細胞肺癌的不良預后呈正相關[11]。此外，有證據顯示miR-20a參與了對細胞自噬功能的負向調節。Guo L等[12]發現miR-20a通過降低巨噬細胞ATG7 與 ATG16L1的表達抑制自噬，從而有助于結核分支桿菌的存活，而Li S等[13]報道了在乳腺癌中miR-20a可靶向于RB1CC1/FIP200復合物降低自噬水平。為進一步探究miR-20a在乳腺癌中扮演的角色，我們首先檢測了乳腺癌組織中miR-20a的表達水平。與先前的報道一致，乳腺癌組織中miR-20a的平均相對表達量高于癌旁組織。

此外，我們檢測了Beclin1、Atg5、Atg7及Atg12共4種自噬相關基因mRNA的表達量。結果顯示，腫瘤組織Beclin1 mRNA的表達水平顯著低于癌旁組織，而Atg5、Atg7與Atg12 mRNA表達量的兩組間比較差異無統計學意義。目前認為，細胞自噬對腫瘤的發生與生長具有雙向作用。由于腫瘤組織代謝旺盛，生長較快時能量需求更高，在周圍環境提供能量不足時自噬可通過降解長壽命蛋白為其提供營養，維持腫瘤細胞的存活。特別在患者接受放療或化療時，物理及化療藥物對細胞的殺傷作用和細胞功能的干擾，可導致蛋白質和細胞器的大量損傷[14]。而自噬活化可對其降解為營養物質并再利用，在放化療的應激條件下對癌細胞發揮保護作用。與此同時，自噬對腫瘤的發生具有抑制作用，自噬水平過低可增加DNA損傷與基因突變，而Beclin1是第一個被確認的自噬相關抑癌基因[15-16]。

在觀察到乳腺癌組織中miR-20a表達升高與Beclin1 mRNA表達降低后，我們利用了乳腺癌細胞系MCF7探究了二者之間的相互關系。通過重組質粒載體過表達miR-20a后，免疫蛋白印記實驗顯示Beclin1蛋白表達水平降低。進而，我們發現過表達miR-20a后MCF7細胞LC3Ⅱ蛋白表達量與自噬體數量均明顯降低，顯示miR-20a對于乳腺癌細胞的自噬功能具有負向調節作用。

綜上所述，我們首次發現了在乳腺癌中miR-20a通過降低自噬調節蛋白Beclin1的表達以抑制自噬的作用。后續我們將進一步探究miR-20a與Beclin1 mRNA的直接相互作用，為乳腺癌發生、發展的分子機制提供更多的理論依據。

(本文圖1～3見插圖10-2)