倍芪腹瀉貼微生物限度檢查方法的適用性試驗

衛延明，閔朕，陳子龍，杜思迪，秦亞紅

(陜西省渭南市食品藥品檢驗所，陜西 渭南 714000)

倍芪腹瀉貼是一種含藥材原粉的中藥制劑，其主要成分為五倍子、黃芪、肉桂和木香，具有收澀斂肺、補氣健脾、益腎助陽的功效，主要用于脾肺氣虛、脾腎陽虛所致的腹瀉，自汗，盜汗及遺尿的輔助治療。倍芪腹瀉貼處方中黃芪的主要有效成分為黃芪多糖和黃芪皂苷，其中黃芪皂苷對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌都有明顯的抑菌作用。本文按照《中國藥典》2015年版四部﹝通則1105和通則1106﹞的具體要求[1]，建立倍芪腹瀉貼的微生物限度檢查方法。

1 儀器與材料

1.1儀器MJ-Ⅱ型真菌培養箱(上海一恒科技有限公司)，SPX-150型生化培養箱(上海金慧科電子有限公司)，SPX-250B-Z型生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，HTY-2000集菌儀(杭州高得醫療器械有限公司)。

1.2樣品及試劑倍芪腹瀉貼(陜西海普藥業有限公司生產，批號20160901，規格：每貼重1.5 g)；培養基：胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、麥康凱液體培養基、麥康凱瓊脂培養基、pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液、蛋白胨；氯化鈉和吐溫80。沖洗液：0.1%無菌蛋白胨水溶液。

1.3試驗菌種銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]均由青島高科園海博生物技術有限公司提供。

菌液制備：分別取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的瓷珠1粒至10 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，35 ℃培養24 h。將金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液；再將枯草芽孢桿菌的培養物接種至胰酪大豆胨瓊脂斜面培養基上，35 ℃培養7 d，然后加入5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液進行適當振搖，并于65 ℃水浴中加熱30 min，取該培養物1 mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液。

取白色念珠菌的瓷珠1粒至10 mL的沙氏葡萄糖液體培養基中，25 ℃培養48 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的瓷珠1粒至10 mL的沙氏葡萄糖液體培養基中，25 ℃培養5 d。將上述黑曲霉培養物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，25 ℃培養7 d，再加入5 mL含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液進行洗脫，吸取孢子懸液1 mL，用含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液[2-7]。

1.4供試品溶液的制備取供試品6～7貼(10 g)，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌紗布，并用滅過菌的剪刀將其剪成小塊狀，放入含5%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，強力振蕩使其溶解[2]，然后用無菌紗布以無菌方式將其過濾到一個無菌玻璃容器中，制備成1∶10的供試液A；取1∶10供試液40 mL至上述稀釋液40 mL中，混勻，制備成1∶20供試液B；取1∶10供試液20 mL至上述稀釋液80 mL中，混勻，制備成1∶50供試液C；取1∶10供試液10 mL至上述稀釋液90 mL中，混勻，制備成1∶100供試液D。

2 方法

2.1計數方法適用性試驗

2.1.1平皿法(1∶10、1∶20、1∶50、1∶100) 取相應稀釋級別的供試液(A、B、C、D)9.9 mL和0.1 mL的試驗菌液，混勻，取混合液1 mL置平皿中，立即傾注15～20 mL培養基，待凝固后置規定溫度培養，需氧菌培養3 d，真菌和酵母菌各培養5 d，記錄菌落數，作為試驗組。其中，5種需氧菌(枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉)和2種真菌和酵母菌(白色念珠菌、黑曲霉)共計7個試驗組，每個試驗組平行制備兩個平皿；同法測定相應的試驗菌菌落數，作為菌液組；測定供試品的本底菌落數，作為供試品對照組。按照公式計算回收比值：回收比值=(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數)，結果見表1。

2.1.2稀釋法(1∶100)+薄膜過濾法(方法1：300 mL,方法2：500 mL) 取1∶100 供試液10 mL，采用薄膜過濾法(在第1次沖洗液中加入供試液,在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu的試驗菌0.1 mL),用沖洗液(方法1：300 mL，方法2：500 mL)沖洗，每次100 mL,在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu的試驗菌，濾干，取出濾膜貼于培養基平板上，作為試驗組并測定其菌落數；同法測定供試品本底菌落數，作為供試品對照組；菌液組同平皿法。最后按照平皿法公式計算回收比值，結果見表1。

2.2控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)檢查方法適用性試驗

2.2.1試驗組 (1)常規法：取1∶10供試液10 mL和不大于100 cfu的試驗菌接種至100 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，依據各試驗菌檢查項下的方法進行試驗，結果見表2。(2)培養基稀釋法(200 mL、400 mL) 取1∶10供試液和不大于100cfu的試驗菌分別接種至200 mL和400 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，依據各試驗菌檢查項下的方法進行試驗，結果見表2。(3)薄膜過濾法(方法1：沖洗300 mL,方法2：沖洗500 mL)。取1∶20供試液20 mL，薄膜過濾，用沖洗液(方法1：300 mL,方法2：500 mL)沖洗，每次100 mL，在第一次沖洗液中加入供試液，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗菌，濾干，轉移濾膜至100 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，依據各試驗菌檢查項下的方法進行試驗，結果見表2。

表1 微生物限度計數方法適用性試驗回收比值結果

注：-表示未進行試驗；x代表需氧菌，m代表真菌和酵母菌

2.2.2陽性對照組 取不大于100 cfu的試驗菌依據各方法項下的試驗組方法進行試驗，結果見表2。

2.2.3陰性對照組 取稀釋液替代供試液，依據各試驗菌檢查項下的方法進行試驗，結果見表2。

表2 控制菌檢查方法適用性試驗結果

注：“﹢”代表檢出，“-”代表未檢出

3 結果

3.1計數方法試驗結果由表1可見，倍芪腹瀉貼對三種細菌有很強的抑菌作用，平皿法和薄膜過濾法方法1都不適用于需氧菌總數的測定，應采用稀釋法(1∶100)+薄膜過濾法(500毫升/膜)進行需氧菌總數的測定；可采用平皿法(1∶10)進行真菌和酵母菌總數的測定[8-9]。

3.2控制菌檢查方法試驗結果常規法、培養基稀釋法(200 mL、400 mL)和薄膜過濾法方法1的試驗組均未檢出試驗菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)，因此不可用于控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢查。薄膜過濾法2(1∶20，沖洗500 mL)的試驗組均檢出試驗菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)，因此可用于控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢查。見表2。

4 討論

4.1供試液的制備問題普通貼劑藥層薄，面積較大，而且藥層下面都粘連著一層塑料薄膜，不易進行有效成分的重量稱量。因此藥典規定貼劑在進行微生物限度檢查時，供試液的制備應取100 cm2至100 mL的稀釋液中進行振蕩溶解，而不是按照普通方法稱取10 g至100 mL的稀釋液中進行制備。但倍芪腹瀉貼呈圓柱形，整體外觀厚而小，而且操作起來相當不便，并且制備出來的溶液過于黏稠，根本無法吸取[10-11]。鑒于此，筆者在進行方法適用性試驗前，先對該貼劑的標示規格進行了復核，最終確定該藥的實際規格約為1.5 g，也就是說制備1∶10的供試液，供試品的稱樣量為6～7貼，這大大降低了溶液的黏稠度，為試驗的順利進行打下了良好的基礎。

4.2枯草芽孢桿菌菌懸液的制備問題枯草芽孢桿菌是需氧芽孢桿菌屬，芽孢是其賴以長期存活的主要形式。藥典方法培養時間短，芽孢含量較少，菌懸液很不穩定。因此，菌液計數與試驗計數結果差別很大，這大大增加了實驗室人員的工作量。枯草芽孢桿菌的生活周期包括繁殖期、孢子囊期和芽孢期，要形成芽孢，一般需要在斜面上培養7 d左右。因此，筆者首先將枯草芽孢桿菌的培養物接種至胰酪大豆胨瓊脂斜面上培養7 d，然后用稀釋液沖下菌苔，并將其放入65 ℃水浴加熱30 min，這樣做的目的是使該菌體菌懸液徹底變成芽孢菌懸液，最后再進行稀釋計數，而且枯草芽孢桿菌的芽孢菌懸液的氯化鈉稀釋液在2～8 ℃可保存3個月左右，這不僅減輕了工作量，也提高了工作效率，節約了成本[12-15]。

4.3薄膜過濾法中供試液的濃度選擇問題

4.3.1計數試驗 2015版藥典規定所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%，這主要是為了減小誤差，降低菌液體積對供試液的稀釋作用，從而提高檢測結果的準確度。而我們一般使用的吸管的最小刻度為0.1 mL，也就是說菌液的最小加入體積為0.1 mL，按1%的比例進行換算，那么供試液的最少加入量應為10 mL。因此，選擇低稀釋級的供試液進行薄膜過濾顯然行不通(正式試驗之前進行了預試驗)，考慮到倍芪腹瀉貼的抑菌性又太強，綜合上述因素我們最終選擇1∶100的供試液進行薄膜過濾。

4.3.2控制菌檢查試驗 倍芪腹瀉貼1∶10的供試液由于黏稠度很大，直接取10 mL進行控制菌檢查中的薄膜過濾，很難過濾下去，影響試驗的順利進行。按照過去的方法，應該采用離心沉淀法去消除這個影響，但中國藥典2015版微生物限度檢查已不允許使用離心沉淀法制備供試液。因此，我們對供試液首先進行了1∶20的稀釋，降低了供試液的黏稠度，然后進行過濾，效果很好。另外，控制菌檢查中供試液的加入量是取相當于1 g供試品的供試液量，所以1∶20供試液的過濾量應該是20 mL，而不是10 mL[16-17]。

本研究在用薄膜過濾法進行微生物限度的方法適用性試驗中,由于藥品本身黏稠度過高,以1∶10的供試液直接進行沖洗,出現堵膜現象,影響了試驗的順利進行。因此,針對供試液黏稠度過高的藥品,在進行薄膜過濾法的沖洗試驗中,應首先對其進行適度稀釋,然后再進行沖洗試驗。