野花麥體內(nèi)Pb對(duì)其生理性質(zhì)的影響

李娟娟 梁寧剛 蔡卓 蔣翠文 葉丹妮

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530004)

野花麥屬多年生藥食同源的草本植物，具有殺菌消炎、清熱解毒、利尿消腫等功效[1～3]，對(duì)于治療熱痢、肺炎、濕疹等癥療效較好[4，5]。野花麥含有黃酮、蛋白質(zhì)、多糖等成分，因而作為重要原料已廣泛應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)中。我國(guó)許多地區(qū)是野花麥分布區(qū)域，具有種植的潛力，然而野花麥的種植同樣面臨重金屬污染的威脅。Pb是植物生長(zhǎng)的非必需元素，會(huì)通過(guò)大氣、水體及土壤等系統(tǒng)遷移至植物體內(nèi)毒害其生長(zhǎng)，還可通過(guò)食物鏈危害人體健康[6，7]。目前Pb對(duì)作物影響的研究已有報(bào)道[8]，但對(duì)草本中藥影響的研究還不多見(jiàn)。本文通過(guò)盆栽種植野花麥并進(jìn)行鉛污染處理，測(cè)定植株可溶性蛋白、總黃酮及葉綠素的變化情況，從而探討Pb對(duì)野花麥生理性質(zhì)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑及實(shí)驗(yàn)材料

牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)(G-250) 、蘆丁等標(biāo)液均購(gòu)于國(guó)藥試劑有限公司，L-半胱氨酸購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制藥有限公司。實(shí)驗(yàn)采用分析純等級(jí)試劑，去離子水為實(shí)驗(yàn)用水。野花麥于2016年2月購(gòu)自玉林中藥市場(chǎng)。

1.2 野花麥污染處理與采集

將野花麥幼苗(株高約30 cm)種植于盆中，深約5 cm，以水澆淋。待生長(zhǎng)穩(wěn)定，每天澆灌20 mL Pb(NO3)2溶液(濃度分別為250、500、1000、1500、2000 mg/kg)，期間保持光照、濕度等條件一致。記錄植株生長(zhǎng)的狀況。

采集各生長(zhǎng)時(shí)期(20、40、60d)的樣品，于105℃下烘干，冷卻后保存于密封袋中。

1.3 樣品的消解及Pb的測(cè)定

稱(chēng)取烘干野花麥0.1000 g于100 mL燒杯內(nèi)，加入20mL HNO3-HClO4(5∶1)，浸泡12h，于電熱板上加熱至白煙冒盡，再加HClO44mL加熱至無(wú)白煙，冷卻后溶液定容至50mL。用原子吸收法測(cè)定消解液中的Pb[9]。

1.4 可溶性蛋白含量的測(cè)定

將0.1000 g鮮樣放進(jìn)研缽中，加入1.0 mL 0.50 mmol/L L-半胱氨酸、4.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液( pH=7.8)、1.0 mL 0.05 mol/L Na2SO4及0.5克石英砂，搗碎成漿，于2000 r/min離心10 min，上清液導(dǎo)入比色管(15mL)；殘?jiān)俅渭尤胍后w提取，合并所得上清液后定容，即為提取液。移取1.0 mL提取液和2.0 mL考馬斯亮藍(lán)(G-250)工作液，放入15mL比色管定容，測(cè)其595 nm的吸光度，進(jìn)而算出可溶性蛋白含量[10，11]。

1.5 總黃酮含量的測(cè)定

在0.1000 g鮮樣中加入4mL 90%乙醇，超聲1h，用等量石油醚在分液漏斗中提取3次，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于80℃蒸干，以60℃熱水溶解所得膠狀物并定容于50 mL，即為提取液。取10.0 mL提取液于50 mL容量瓶中，加入1.4 mL 0.72 mol/L NaNO2，1.4 mL 0.27 mol/L Al(NO3)3，靜置5 min，加入10.0 mL 1.5 mol/L NaOH，以30%乙醇定容后測(cè)定其545 nm的吸光度，并計(jì)算總黃酮含量[12，13]。

1.6 葉綠素含量的測(cè)定

將0.1000 g鮮樣放入研缽中，加5mL丙酮-乙醇-水 (4.5∶4.5∶1) 溶液，研磨，漏斗過(guò)濾，提取三次，所有濾液轉(zhuǎn)至50mL量瓶并定容。測(cè)定其663、645 nm的吸光度。將A663和A645代入式(1)、(2)、(3)中，得到Ca、Cb和Ct，再按式(4)算出葉綠素含量[14]。

Ca=12.7A663-2.69A645

(1)

Cb=22.9A645-4.68A663

(2)

Ct= Ca+ Cb=20.2A645+8.02A663

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb在野花麥體內(nèi)的累積分布

從表1數(shù)據(jù)中可以看出，各個(gè)部位Pb含量與澆灌液Pb濃度成正比，分布情況為莖部>根部>葉片。污染20 d時(shí)，野花麥的生長(zhǎng)與未受污染時(shí)無(wú)差異。當(dāng)40 d后，1000 mg/kg Pb處理下植株頂部葉片開(kāi)始出現(xiàn)泛黃萎縮現(xiàn)象，而500 mg/kg Pb處理下植株仍保持翠綠。60 d時(shí)，澆淋500 mg/kg Pb溶液的植株有莖部萎縮、葉片枯黃的現(xiàn)象；250 mg/kg Pb處理下植株葉片枯萎但部分莖部仍有綠色。

2.2 Pb對(duì)可溶性蛋白含量的影響

隨Pb的增加野花麥各部位可溶性蛋白含量都有降低的趨勢(shì)(圖1)。20 d時(shí)葉片可溶性蛋白變化不大，但40 d時(shí)快速降低，說(shuō)明葉片此時(shí)已受到Pb的明顯毒害(圖1a)；60 d 時(shí)葉片中可溶性蛋白含量迅速降低，此時(shí)Pb與可溶性蛋白含量的線性回歸方程是y=-37.532x+11.500，r=0.915，P<0.030，為顯著負(fù)相關(guān)。莖部可溶性蛋白在20 d時(shí)變化不大(圖1b)，40d開(kāi)始下降，60 d則明顯下降。Pb與可溶性蛋白含量在60 d時(shí)的回歸方程是y=-5.471x+8.196，r= 0.941，P<0.017，呈顯著負(fù)相關(guān)。根部可溶性蛋白隨Pb污染的增加而不斷下降(圖1c)，60 d時(shí)兩者的回歸方程為y= -11.086x+12.165，r= 0.966，P<0.007，表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)。這與Pb對(duì)可溶性蛋白合成所形成的可能干擾有關(guān)。

表1 Pb在野花麥體內(nèi)的分布(n=3)

圖1 Pb對(duì)野花麥葉片(a)、頸部(b)、根部(c)可溶性蛋白含量的影響

2.3 Pb對(duì)總黃酮含量的影響

葉片總黃酮含量隨Pb的增加而下降(圖2a)。60 d時(shí)葉片Pb與總黃酮含量的回歸方程是y= -6.962x+3.079，r= 0.912，P<0.031，為顯著負(fù)相關(guān)。莖部總黃酮隨著Pb增加所呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)是先升高后降低 (圖2b)，說(shuō)明莖部初期對(duì)Pb污染有一定的耐性，總黃酮升高，但40 d 后開(kāi)始下降，60d后則迅速下降。Pb與總黃酮含量在60d時(shí)的回歸方程是y= -4.990x+4.845，r= 0.910，P<0.032，為顯著負(fù)相關(guān)。根部總黃酮隨Pb增加而快速下降 (圖2c)，60 d 時(shí)Pb含量與總黃酮含量的回歸方程為y= -4.999x+3.639，r= 0.942，P<0.016，為顯著負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明野花麥體內(nèi)的Pb對(duì)黃酮的合成有明顯的抑制作用，Pb含量越高總黃酮含量下降越明顯。

圖2 Pb對(duì)野花麥葉片(a)、頸部(b)、根部(c)總黃酮含量的影響

圖3 Pb對(duì)野花麥葉片(a)、莖部(b)葉綠素含量的影響

2.4 Pb對(duì)葉綠素含量的影響

葉片葉綠素隨Pb的增大先是略有升高，然后下降(圖3a)，從40d開(kāi)始葉綠素就明顯下降，同時(shí)葉片的外觀也變?yōu)榭蔹S。莖部葉綠素也是先升高后降低(圖3b)，40d后快速下降，60 d后急速降低，同時(shí)莖部也開(kāi)始萎縮。數(shù)據(jù)分析顯示，Pb與葉綠素之間為顯著負(fù)相關(guān)，在60 d 時(shí)莖部、葉片葉綠素與Pb的回歸方程分別為y= -2.051x+1.731，r= 0.984，P<0.002和y= -14.463x+3.107，r= 0.935，P<0.020。可見(jiàn)，Pb能破壞植株合成葉綠素的機(jī)制，使植物的正常生理活動(dòng)受到影響，Pb含量越高，危害越嚴(yán)重。

3 結(jié)論

在Pb污染的土壤上種植野花麥，Pb會(huì)進(jìn)入其植物體內(nèi)積累，積累量與Pb處理量成正比，積累分布的規(guī)律為莖部>根部>葉片。在Pb的毒害作用下，野花麥葉片、莖部和根部的可溶性蛋白、總黃酮及葉綠素等生理生化指標(biāo)均不同程度地發(fā)生變化。在污染初期，低濃度的Pb刺激了野花麥自身的應(yīng)激機(jī)制，造成野花麥莖部的總黃酮以及葉片和莖部的葉綠素等生理指標(biāo)高于對(duì)照組，說(shuō)明野花麥對(duì)Pb的毒害有一定的耐受能力。隨著Pb含量的增加，野花麥的各項(xiàng)生理指標(biāo)均有明顯的下降。表明當(dāng)野花麥體內(nèi)Pb的毒害作用超過(guò)植物的耐受極限時(shí)，其自身的新陳代謝活動(dòng)會(huì)受到破壞或抑制，正常生長(zhǎng)受到損害，各部位的生理生化指標(biāo)也受到影響。